Autoanticorpi nella malattia celiaca
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- Fulvio Franceschi
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1 Corso Residenziale La Diagnostica di Laboratorio delle Malattie Autoimmuni Organo-Specifiche Autoanticorpi nella malattia celiaca Nicola Bizzaro Laboratorio di Patologia Clinica Ospedale di Tolmezzo (UD) Bassano, 7-9 ottobre 2009 Il passato La malattia celiaca era considerata una grave forma di allergia alimentare Era considerata una patologia rara (1:5000) La diagnosi si faceva in relazione ai segni e sintomi e sulla base della biopsia duodeno-digiunale Cosa sappiamo oggi della malattia celiaca Genetica La celiachia è una malattia autoimmune La prevalenza è 1/180 Conosciamo il fattore scatenante (glutine) Conosciamo il fattore genetico (HLA DQ2/8) Conosciamo il meccanismo immunologico che provoca il danno d organo Conosciamo la terapia (dieta) Alleli che codificano per uno specifico eterodimero HLA-DQ2 or DQ8 sono presenti all incirca nel 100% dei pazienti con MC. Eterodimero DQ2 (alleli DQB1*0201 or *0202 e DQA1*05) è presente nel 90-95% dei soggetti con MC. Eterodimero DQ8 (alleli DQB1*0302 e DQA1*03) è presente nel restante 5-10% dei pazienti. Distribution of HLA-DQ2 and DQ8 in the general population and in patients with celiac disease Basi biochimiche dell intolleranza al glutine Il glutine è composto da gliadine e glutenine. Gliadine, glutenine, secaline (segale) e ordeine (orzo) sono ricche in glutamina e prolina. L elevato Granocontenuto in prolina Segalerende queste Orzo proteine relativamente resistenti alla digestione proteolitica da parte degli enzimi gastrici, pancreatici e intestinali. Ciò comporta la presenza di peptidi di grandi dimensioni nell intestino tenue e il loro contatto prolungato con la mucosa.
2 Courtesy E. Tonutti Schuppan D. Gastroenterology 2000; 119:234 Courtesy E. Tonutti Schuppan D. Gastroenterology 2000; 119:234 Classificazione istologica di Marsh-Oberhuber Tipo I Tipo II Tipo III a b c Infiltrazione di linfociti Tγδ (CD3+ CD4- CD8-) intraepiteliali >40/100 cellule intraepiteliali + iperplasia delle cripte intestinali + atrofia dei villi lieve moderata totale Cosa non sappiamo della malattia celiaca Su 7 persone con la malattia: 1 lo sa 6 non lo sanno The coeliac iceberg in Italy. A multicentre antigliadin antibodies screening for coeliac disease in school-age subjects (Catassi C, et al. Acta Paediatr Suppl 1996). The celiac disease iceberg Clinical CD Silent CD Manifest mucosal lesion Abs and Autoabs PRESENTAZIONI CLINICHE DELLA MALATTIA CELIACA Sintomi intestinali,anticorpi presenti, mucosa alterata Manifestazioni extraintestinali, anticorpi presenti, mucosa alterata Logan Dyn Nutr Res 1992 Latent CD Potential CD Normal mucosal morphology HLA DQ2/DQ8 Classica Silente Latente Potenziale Sintomi assenti, anticorpi presenti, mucosa intestinale normale Alterazioni geniche, non sintomi, mucosa intestinale normale
3 Dati clinici e di laboratorio in scolari con malattia celiaca silente % Anemia sideropenica 24 Carenza marziale (senza anemia) 22 Algie addominali ricorrenti 20 Cambiamenti di umore 14 Stomatiti ricorrenti 9 Perdita dell'appetito 8 Diarrea ricorrente/cronica 7 Ipostaturismo 6 Distensione addominale 4 Stipsi 2 Ipoalbuminemia 2 Aumento delle transaminasi 2 Deficit selettivo di IgA 2 MALATTIE CHE SI ASSOCIANO A CELIACHIA MALATTIE AUTOIMMUNI Epatite autoimmune Diabete tipo I AITD Sindrome di Sjögren M. diaddison MALATTIE GENETICHE Sindrome di Down Sindrome di Turner Deficit di IgA DISORDINI PSICO- NEUROLOGICI Atassia Autismo Depressione Epilessia Miastenia gravis Miocardiopatia dilatativa The coeliac iceberg in Italy. A multicentre antigliadin antibodies screening for coeliac disease in school-age subjects. (Catassi C, et al. Acta Paediatr Suppl 1996) Il corretto utilizzo dei test di Lab permette di diagnosticare la quasi totalità dei soggetti celiaci Test consolidati Nuovi test I test di laboratorio consolidati ANTICORPI: Anti-gliadina (AGA) AUTOANTICORPI: Anti-reticolina (ARA) Anti-endomisio (EMA) Anti-transglutaminasi (ttg) ALTRI TEST: Dosaggio IgA totali Antigeni HLA classe II Biopsia duodeno digiunale IgA e IgG IgA e IgG IgA e IgG IgA e IgG AGA e ARA ANTICORPI ANTI-ENDOMISIO (EMA) AGA IgA e IgG: bassa sensibilità e specificità. ELISA esofago vescica ARA IgA e IgG: elevata specificità ma bassa sensibilità. EMA IgA: elevatissima specificità (~100%) se correttamente interpretati; sensibilità ~95% cordone ombelicale
4 Clinical Chemistry 2004, 50: Mean sensitivity* 96% Mean specificity 99% * Adults + children Specificità degli anticorpi nella MC Tonutti E, et al. J Clin Pathol 2003 Età Nr EMA ttg IgA AGA IgA AGA IgG < > 2 < > Totale Sensibilità degli anticorpi nella MC A prospective study of the incidence of childhood celiac disease (Hoffenberg EJ, et al. J Pediatr 2003) Tonutti E, et al. J Clin Pathol 2003 Età Nr EMA ttg IgA AGA IgA AGA IgG < > 2 < > Totale
5 Predittività degli autoanticorpi Mäki M, et al. Prevalence of celiac disease among children in Finland. N Engl J Med 2003; 348: studenti (7-16 anni) per IDDM ttg IgA e/o EMA IgA+ 10 CD già diagnosticata nel periodo 10 rifiuto biopsia 36 biopsia 27 CD 80% dei pazienti positivi 6 anni prima della diagnosi. e gli anti-ttg IgG? Che ruolo hanno gli anticorpi anti-ttg di classe IgG? Possono sostituire gli AGA IgG? Hanno la stessa sensibilità nei bambini piccoli? Sono anch essi, come gli AGA, poco specifici? Come si comportano nel celiaco con deficit di IgA? IgA and IgG tissue transglutaminase antibody prevalence and clinical significance in connective tissue diseases, inflammatory bowel disease, and primary biliary cirrhosis. Bizzaro N, et al. Dig Dis Sci 2003 Disease no. of patients Anti-tTG positive IgA IgG no. % no. % HOW USEFUL IS IT TO PERFORM IgG ANTI-TISSUE TISSUE TRANSGLUTAMINASE ANTIBODY TEST FOR THE DIAGNOSIS OF CELIAC DISEASE? Bizzaro N, Tonutti E, et al. 4th International Congress on Autoimmunity Budapest, November 2004 Results IgG IgAanti-tTG and EMA + 17 IgG anti-ttg (3.1%) only IgG + 86 SLE RA SSc SS PBC 48 4 * * 8.3 UC Crohn Total Healthy subjects * 3 PBC patients were positive for both IgA and IgG Intestinal biopsy + IgG neg in follow-up 7 HLA CD on GFD IgA def. CD 10 2 HLA DQ2-DQ8 follow-up refused HLA + 18 biopsy + biopsy (6 adulti) (7 <2 anni) follow-up lost to follow-up in prog. 12 IgG anti-ttg in soggetti con MC e deficit di IgA I NUOVI TEST Anti-peptidi gliadinici deamidati (DGP) Anti-complesso ttg/dgp (cross-links) Anticorpi anti-actina IgA anti-ttg intestinali Test rapidi per autoanticorpi
6 Pro Antibody recognition against native and selectively Deamidated Gliadin Peptides Aleanzi M, et al. Clin Chem 2001; 47: Accuracy of testing for antibodies to synthetic gliadinrelated peptides in celiac disease Mean IgA and IgG reactivities against native and deamidated peptides. Shown are the mean absorbances, with 95% confidence intervals, obtained for each peptide and group of patients. Peptides: native peptide-1 deamidated peptide-1 native peptide-2 deamidated peptide-2 Groups of patients: A, nontreated CD patients (n = 31) B, CD patients being treated with GFD (n = 9) C, non-cd controls (n = 30) Sensibilità % Specificità % DGP IgA DGP IgG Sugai E, et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2006; 4: Niveloni S. et al. Clin Chem 2007; 53: Villalta D, et al. Clin Chim Acta 2007; 382: pazienti sottoposti a biopsia duodenale per disordini intestinali 60 CD - 81 non CD 29 paz. CD con deficit IgA Se % Sp % AGA IgG DGP IgG Sensibilità % Specificità % DGP IgA DGP IgG ttg IgA controlli (9 con deficit IgA e disordini intestinali) Changes in ttg conformation Pinkas DM, et al. PLoS Bio 2007 Antibodies to ttg-dgp crosslink Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu O ttg C C O N NH 2 H 2N H Lys crosslinking DGP lega la ttg Modificazione conformazionale Complesso DGP-tTG
7 Diagnostic accuracy of a new immunoassay for the detection of celiac disease-associated autoantibodies based on the complex of ttg cross-linked to deamidated gliadin peptides (Tozzoli R, et al. 2008) ttg ttg New ELISA test for combined detection of CD antibodies Patients Celiac disease 41 Autoimmune rheumatic diseases (SLE, RA, SSc) 176 Organ-specific autoimmune diseases (AITD, PBC, BCD) 295 Infectious diseases (virus, bacteria, etc) 106 Healthy subjects 80 Results Sensitivity (%) 95.1 Specificity (%) 97.9 gliadin pep. antibodies mod. gliadin pep. antibodies ttg-antibodies crosslinked ttg antibodies unspecific Clemente MG, et al. Gut 2000 Carroccio A, et al. IgA anti-actin antibodies ELISA in coeliac disease: a multicentre study. Dig Liv Dis 2007; 39: CD with partial villi atrophy 41/60 (69%) CD with total villi atrophy 123/145 (85.3%) Healthy controls 1/80 (1.3%) Disease controls 23/81 (28%) Anti-actin antibodies correlate with the degree of intestinal villous atrophy Villalta D, et al (Ann NY Acad Sci, 2009) 58 paz. con MC 100 r 2 = AU IgA-AAA IIIa IIIb IIIc Marsh Anti-actina IgA Sensibilità e specificità di diversi marcatori nel predire l atrofia l dei villi 48 paz. con sospetto di CD e istologia normale (7 anni follow-up) Sensibilità in 17 paz. con CD Specificità in 31 paz. senza CD Sensibilità % Specificità % Depositi intestinali di IgA anti-ttg IgA EMA/ARA siero IgA-AAA UA 50 8 paz. ribiopsiati dopo GFD Aumento di IEL γδ Aumento CD HLA DQ2-DQ a-ttg 0 Basale Parziale Totale Remissione Salmi TT, et al. Aliment Pharmacol Ther 2006;
8 prima IgA IgA anti-ttg I test rapidi dopo ttg su sangue intero su siero ttg Test rapidi per autoanticorpi Rapid assays A StickCD1 (Operon, Spagna) siero B Biocard CD (AniBiotech, Finlandia) sangue intero Sensibilità 100% Specificità 95% Sensibilità 96% Specificità 100% Am J Gastroenterol 2006;101: Nemec G, et al. Looking for celiac disease: diagnostic accuracy of two rapid commercial assays. Eurospital Trieste CD Screen ttg IgA / AGA IgA Nunc- Immunostick (Danimarca) Linea di controllo Linea del test AGA Linea del test ttg Sensibilità: 96.2% Specificità: 90.3% (Not T, et al 2008, dati non pubblicati) Test rapido EMA IgA ttg IgA Sensibilità % 100* Specificità % * 1 con deficit di IgA Aliment Pharmacol Ther 2005;22: Korponay-Szabo IR, et al. Coeliac disease case finding and diet monitoring by point-of-care testing.
9 HOW IS CELIAC DISEASE DIAGNOSED? NIH Consensus Statement on Celiac Disease, 2004 Algoritmi diagnostici The first step in pursuing a diagnosis of celiac disease is a serologic test. The best available tests are the IgA anti-ttg and IgA EMA tests that appear to have equivalent diagnostic accuracy. Anti-gliadin antibody (AGA) tests are no longer routinely recommended because of their lower sensitivity and specificity, especially in adults and children of more than 2 years of age. EMA or ttg? EMA: immunofluorescence Operator dependent Time consuming Semi-quantitative results ttg: ELISA Operator independent Fast Quantitative results EMA, ttg or both? Systematic review: the use of serology to exclude or diagnose coeliac disease (a comparison of the endomysial and tissue transglutaminase antibody tests) Lewis & Scott, Aliment Pharmacol Ther 2006, 24:47-54 Sensitivity Specificity EMA better Equal ttg better 28% (5 studies) 56% (10 studies) 28% (5 studies) 22% (4 studies) 44% (8 studies) 22% (4 studies) Which tests should be performed in subjects with suspected CD? Diagnosis of CD can be accurately made by using 4 tests: Anti-tTG IgA Anti-DPG IgA and IgG EMA IgA (for confirmation) AGA and ARA are obsolete Anti-actin for monitoring (needs confirmation) ttg-dpg crosslinks need further studies Intestinal anti-ttg IgA only in selected centers (needs biopsy) Mini-survey on the use of antibody tests for CD 15 Italian Labs (January 2009) Test % ttg IgA 100 IgG 86 EMA IgA 100 AGA IgA 73 IgG 73 DGP IgA 27 IgG 27 F actin IgA 27 Cross-links IgA 0 IgG 0
10 Flow chart for the diagnosis of of celiac disease ttg IgA + total IgA ttg negative non IgA deficiency STOP Linee guida per la diagnosi di laboratorio e istologica della malattia celiaca ttg IgA positive EMA IgA ttg IgA negative <5 yrs DGP IgA and IgG Total IgA deficiency ttg (or DGP) IgG E. Tonutti, D. Visentini, N. Bizzaro, D. Villalta, M. Bagnasco, R. Tozzoli, et al. negative positive negative positive positive negative Riv It Med Lab 2005; 2: haplotype biopsy STOP haplotype biopsy STOP negative positive negative positive control biopsy STOP biopsy AUTOMATED REFLEX TESTING FOR CD ALGORITHM OF AUTOMATED REFLEX TESTING FOR CD, INDEPENDENT FROM TOTAL IgA Anti-tTG and anti- DPG IgA very low OD? Anti-DGP IgG OD anti-ttg Abs ttg cut-off Total serum IgA (mg/dl) N. Bizzaro, Winter Meeting on Autoimmunity, Courmayeur 2009 Il referto interpretativo What happens to patients with positive tissue transglutaminase and endomysium antibody results in general practice? (Sinclair D, et al. J Clin Pathol 2004) Prima del commento: biopsiati 18% Dopo il commento: biopsiati 80% Linee guida GdS-AIA SIMeL per la diagnosi di laboratorio e istologica della malattia celiaca Il referto di Laboratorio deve includere, nei casi appropriati, un commento esplicativo con l indicazione ed eventualmente la prescrizione degli esami necessari per il completamento dell iter diagnostico (la ripetizione degli esami, altre indagini sierologiche, indagini genetiche e la biopsia intestinale).
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