UNIVERSITA DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II FACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA Corso di Laurea in Tecniche Audiometriche TESI DI LAUREA

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II FACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA Corso di Laurea in Tecniche Audiometriche TESI DI LAUREA Diagnosi eziologica e correlazione genotipofenotipo in soggetti Campani affetti da ipoacusia neurosensoriale non sindromica Relatore Ch.mo Dott. Annamaria Franzè Candidata Filomena Filosa Matr.584/31 Anno Accademico

2 a mio padre e a mia madre, per il loro sostegno e la loro comprensione. 2

3 INDICE Capitolo I Introduzione pag.4 Capitolo II Scopi. pag.8 Capitolo III 3.1-Le connessine.. pag La connessina 26, la connessina 30 e la sordità..pag Altre connessine coinvolte nella sordità.. pag.17 Capitolo IV Materiali e metodi 4.1-Selezione dei pazienti pag Analisi strumentale....pag Analisi molecolare. pag.25 Capitolo V Risultati.pag Analisi mutazionale.pag.26 Conclusioni e discussione. pag.39 Bibliografia...pag.41 3

4 Capitolo I Introduzione I deficit uditivi, attualmente, sono molto diffusi ed interessano una larga fascia di soggetti. Nei paesi sviluppati, la sordità è un fenomeno che interessa circa 1 bambino su 1000 (1); di questi almeno il 60% è dovuto a cause genetiche mentre la rimanente parte è dovuta a cause acquisite (2). Le sordità acquisite possono insorgere in epoca prenatale e sono dovute prevalentemente a infezioni materne in gravidanza quali il Citomegalovirus, Rosolia, Toxoplasmosi, all assunzione di farmaci ototossici da parte della madre; possono insorgere in epoca perinatale e sono causate da meningiti, prematurità, ipossia, ittero neonatale; possono insorgere in epoca postatale per l assunzione di farmaci ototossici, infezioni, traumi, neoplasie, patologie vascolari. Le ipoacusie di origine genetica possono essere suddivise in : autosomiche recessive che si manifestano quando entrambe le copie del gene provenienti rispettivamente dal 4

5 padre e dalla madre, sono mutanti (circa l 80% dei casi); autosomiche dominanti, basta una sola copia del gene malato per avere il deficit uditivo( 20% dei casi); X- linked (legate al sesso), si esprime solo nei maschi quando il gene è recessivo (l 1% dei casi); mitocondriali (1% dei casi), forme estremamente rare con una caratteristica ed esclusiva ereditarietà madre-figlio/a. Inoltre vanno distinte le sordità sindromiche da quelle non sindromiche: la differenza sta nel fatto che, mentre nelle forme sindromiche (30% dei casi) sono presenti altri segni e sintomi oltre la sordità a carico di altri apparati, nelle forme non sindromiche (70% dei casi) l ipoacusia non è legata ad altre patologie. Si ritiene che piu di un centinaio di geni possono essere coinvolti nelle forme ereditarie non sindromiche; molti di essi non sono stati ancora identificati. Le forme piu diffuse di sordità ereditaria (circa l 80%) hanno una modalità di trasmissione autosomica recessiva e sono in gran parte dovute a mutazioni dei geni (GJB2, GJB6 e GJB3) che codificano per varie esponenti della famiglia delle connessine, rispettivamente connessina 26 (cx26), 5

6 connessina 30 (cx30) e connessina 31 (cx31), proteine tutte trovate a livello dell organo di Corti (3). L organo di Corti è situato nell orecchio interno, precisamente nel dotto cocleare e rappresenta l organo di senso dell udito.le cellule ciliate esterne e interne, trasformano l energia vibrazionale in energia nervosa trasmessa al cervello tramite l VIII nervo cranico (Figura 1). Figura 1-sezione di una coclea umana-organo del Corti Le mutazioni piu frequenti coinvolgono il gene GJB2 che codifica per la cx26. La mutazione piu comune nella connessina 26 descritta in letteratura è la 35delG, responsabile di un prematuro stop della sintesi della connessina. E stato riscontrato che questa mutazione è la piu frequente nel bacino del Mediterraneo ed è responsabile di circa il 50% dei casi di 6

7 ipoacusia neurosensoriale a trasmissione autosomica recessiva (4). Si è visto che in molti casi in cui viene identificata una mutazione nel gene GJB2 su un solo allele (eterozigoti) si riscontra una situazione digenica in cui oltre al gene GJB2 viene implicato il gene GJB6. Infatti sono state identificate mutazioni nella zona a monte di tale gene (5). Negli ultimi anni sono stati fatti notevoli progressi nell identificazione dei geni coinvolti nelle ipoacusie, ma resta ancora molto da fare sia per quanto riguarda l identificazione dei geni responsabili dell ipoacusia, sia per quanto riguarda i meccanismi molecolari alla base di questa patologia. In questo lavoro di tesi si è cercato di identificare l eziologia dell ipoacusia e di studiare la correlazione genotipo-fenotipo in un campione di soggetti con problemi uditivi neurosensoriali. In particolare si è proceduto ad esaminare audiologicamente questi soggetti ed, in seguito, ad un analisi molecolare nei geni piu comuni coinvolti in tale patologia. 7

8 Capitolo II Scopi L obiettivo del lavoro di questa tesi è stato quello di identificare l eziologia dell ipoacusia in un campione di soggetti Campani affetti da ipoacusia neurosensoriale non sindromica e di effettuare un analisi di correlazione genotipo-fenotipo. Le ipoacusie rappresentano una patologia di elevata incidenza, ma in molti casi, soprattutto nelle forme sporadiche, è spesso difficile stabilire la loro eziologia. Attualmente si stima che circa il 60% delle ipoacusie neurosensoriali possono essere attribuite a cause genetiche. La maggior parte delle sordità ereditarie sono dovute a mutazioni dei geni che codificano per varie esponenti della famiglia delle connessine. In questo studio, per verificare l incidenza dell ipoacusia ereditaria in soggetti appartenenti alla popolazione Campana si è effettuata un analisi molecolare su soggetti affetti, analizzando i principali geni attualmente ritenuti responsabili delle forme di ipoacusia neurosensoriale non sindromica Inoltre si è cercato di realizzare una correlazione genotipo-fenotipo per ottenere in futuro un aiuto nella valutazione etiologica. 8

9 Questi studi quindi potranno fornire dati utili per un migliore inquadramento clinico della sordità che rappresenta un aspetto di notevole importanza clinica e sociale. 9

10 Capitolo III 3.1-Le connessine Le gap junction sono dei contatti specializzati tra le cellule che permettono la comunicazione e il passaggio intercellulare di secondi messaggeri, elettroliti e metaboliti. Le particelle intermembranari delle gap junction sono costituite da sei subunità che circondano un canale centrale; le sei subunità sono disposte ad esagono e formano una struttura chiamata connessone. Ciascuna subunità è formata da una singola proteina, la connessina. E attraverso i connessoni che avviene lo scambio intercellulare (6). (Figura 2) Figura 2. Gap Junction Le gap junction giocano un ruolo molto importante nella funzione cocleare, infatti grazie a loro avvengono scambi di ioni e liquidi tra le cellule e tra le cellule e l ambiente circostante permettendo il 10

11 riciclaggio del potassio quindi il mantenimento di un equilibrio ionico, la generazione di un potenziale endococleare e la trasmissione dell impulso elettrico che viene generato dalle risposte cellulari agli stimoli ambientali (7). Il disturbo dell omeostasi cocleare dovuto a mutazioni dei geni che codificano per determinate connessine presenti nell orecchio interno, è causa di molte forme di sordità. Finora sono stati identificati piu 20 tipi di connessine largamente espresse nell organismo umano (8); la moltitudine delle funzioni cellulari è data dall espressione delle diverse connessine in ogni tipo di cellula (9). Grazie a studi effettuati nell epitelio sensoriale dell orecchio interno di rettili, volatili e mammiferi, è stato possibile accertare e individuare i diversi tipi di connessina che costituiscono le gap junction delle cellule sensoriali dell orecchio interno dei mammiferi. Da questi studi è emerso che nella coclea dei mammiferi sono presenti quattro isotipi (cx 26, cx30, cx31, cx43) mentre nell organo vestibolare sono presenti tre isotipi (cx26, cx30, cx43). La cx26 e la cx30 sono state trovate nella regione basale della stria vascolare, nelle cellule del lembo spirale e nelle cellule di sostegno dell Organo del Corti (Figura 3). 11

12 Figura 3- Sezione della coclea: in viola sono riportate le zone di espressione di cx26 e cx30 nell organo del Corti. La cx31 è collocata nelle cellule situate sotto la prominenza spirale, una regione dove la cx30 non è espressa e la percentuale di cx26 è molto bassa (Figura 4). Figura 4- Sezione della coclea: in viola è riportata l espressione di cx31 nell organo del Corti 12

13 La cx43 è stata individuata solo in alcuni tipi di fibrociti (10). La cx26 e la cx30 possono essere coespresse e formare un eteromero (10). La maggior parte delle sordità ereditarie non sindromiche si trasmettono con una modalità autosomica recessiva e sono dovute soprattutto a mutazioni dei geni che codificano per le connessine. Le connessine coinvolte principalmente in queste mutazioni sono la cx26 e la cx30 codificate dai geni GJB2 e GJB6 che provocano un gran numero di ipoacusie neurosensoriali. Gli effetti che possono provocare queste connessine mutate non sono ancora ben chiari anche se connessoni difettosi ostacolano la trasmissione dell impulso elettrico, non permettono il riciclaggio del potassio e creano un ambiente poco favorevole alla sopravvivenza delle cellule ciliate. Come già detto, il danno della normale funzione ionica e l alterazione dell equilibrio ionico comporta la morte cellulare e la sordità ( 11). 13

14 3.2-La connessina 26, la connessina 30 e la sordita. Piu di trenta loci sono stati indicati come possibili cause di sordità non sindromiche autosomiche recessive (DFNB) ma solo uno, DFNB1, viene considerato il responsabile della maggior parte dei casi di sordità ereditaria non sindromica con trasmissione autosomica recessiva. Il gene coinvolto in questo tipo di sordità è GJB2 che codifica per la proteina connessina 26. Il gene GJB2 è localizzato sul cromosoma 13 (12). Il locus contenente il gene GJB2 mutato fu individuato per la prima volta in famiglie consanguinee della Tunisia (13); un importante contributo fu dato, in seguito, da studi effettuati in 19 famiglie caucasiche (14). Altre osservazioni fatte in 48 famiglie italiane e spagnole sottolinearono l importanza di questo locus nei disturbi uditivi nelle popolazioni del Mediterraneo (15). Infatti le mutazioni nella cx26 sono le piu frequenti nel bacino del Mediterraneo, essendo responsabili di circa il 50% dei casi di ipoacusia neurosensoriale non sindromica. Le percentuali nel resto del mondo sono varie: 30% nel Nord Europa, 40% negli Stati Uniti, 22% in Brasile, 25% in Estremo Oriente, 17% in Ghana e 15% in Australia (3). 14

15 La mutazione più comune nella connessina 26 è la delezione di una singola guanina da una sequenza di sei guanine ed è la 35 del G; questa mutazione causa un prematuro stop della sintesi della proteina (3). Oltre alla 35 del G, che è la più frequente, sono state trovate anche altre mutazioni poco comuni, per esempio, 167delT (15), 235delC (16) ed altre trovate solo in pochi individui (16). Clinicamente l ipoacusia associata alla mutazione 35delG è ad insorgenza preverbale, è neurosensoriale e non è progressiva (17). Mutazioni nella cx 26 possono anche essere, in rari casi, cause di sordita autosomiche dominanti (DFNB3). Sono state individuate nove mutazioni responsabili di sordità dominanti tra cui: M34T, (3); W44C, (18); W44S, (16); R75W, (16); and D66H, (16). Inoltre, alcuni studi affermano che in alcuni casi di mutazioni di GJB2 che provocano sordità, i disturbi uditivi sono associati a problemi cutanei (3, 16). Anche se la maggior parte delle sordità ereditarie è imputata ad una mutazione del gene GJB2 in una condizione di omozigosi, sono stati trovati casi in cui non erano presenti mutazioni della cx26 o si presentava una condizione di eterozigosi quindi la mutazione di un solo allele. Studi su questi casi hanno suggerito la presenza di altri geni coinvolti nella sordità e collocati sullo stesso punto nel 15

16 cromosoma (16). Questa ipotesi è stata confermata dal ritrovamento di due delezioni che non riguardano il gene GJB2 ma interessano il gene GJB6 che codifica per la connessina 30, localizzato nello stesso locus di GJB2. Queste delezioni chiamate del(gjb6-d13s1830) e del(gjb6-d13s1854), sono state trovate in soggetti omozigoti o in doppia eterozigoti con la mutazione di GJB2 (19, 5). Studi hanno dimostrato che la prima delezione (del(gjb6- D13S1830)), è molto frequente in Spagna, Francia, Inghilterra, Israele e Brasile, è meno frequente negli USA, Belgio e Australia e molto rara nel Sud Italia (20). La seconda delezione, identificata più recentemente, anch essa molto frequente in Spagna, è stata identificata solo nel Nord Italia. Inoltre è stato riscontrato che mutazioni di GJB6 risultano in sordità autosomiche dominanti.(21) 16

17 3.3-Altre connessine coinvolte nella sordità. Anche altre mutazioni nei geni che codificano per le restanti connessine presenti in percentuali minori nell orecchio interno possono essere coinvolte nei disturbi uditivi e causare sordità dominanti, recessive o partecipare nelle forme sindromiche. I geni interessati sono: GJB1 che codifica per la connessina 32, una mutazione in questo gene puo causare la forma X-linked Charcot- Marie-Thoot di tipo 1 (22); GJB3 che codifica per la connessina 31, una mutazione in questo gene puo portare sia sordità (23) sia disturbi cutanei (16), dipende da dove è collocata la mutazione. Infine puo essere coinvolto un nuovo gene che è GJA1 che codifica per la connessina 43, solo recentemente è stato dimostrato che una mutazione in questo gene puo causare sordita recessive (16). 17

18 Capitolo IV Materiali e metodi L indagine è stata eseguita su soggetti affetti da ipoacusia non sindromica identificati nell Unità di Audiologia dell Università Federico II di Napoli, nell Istituto Smaldone di Napoli e Salerno ed in varie strutture ospedaliere Campane. 4.1-Selezione dei pazienti Dai soggetti analizzati sono stati selezionati 191 pazienti affetti da ipoacusia neurosensoriale bilaterale; tali soggetti sono tutti di origine Campana tranne 5 che sono di origine non Campana e 3 adottati, su cui quindi non si hanno notizie fa miliari. Sono stati sottoposti ad analisi soggetti con ipoacusia congenita o postverbale insorta prima dei 40 anni di età (con età compresa tra 2 mesi e 56 anni). Sono stati considerati affetti i soggetti con almeno 25 db di perdita nell orecchio migliore. L orecchio migliore è stato valutato con la media dei valori delle frequenze 500, 1000, 2000, Per le misure fuori scala è stato inserito il valore di 125 db. Per i casi familiari è stato considerato un singolo soggetto. 18

19 In una prima fase è stata effettuata un attenta analisi anamnestica dei soggetti selezionati, in modo da poter individuare eventuali altri familiari con una significativa perdita uditiva, compilare un albero genealogico il più dettagliato possibile ed escludere forme sindromiche ed ipoacusie dovute a cause diverse da quelle genetiche. In tal modo è stato possibile avere informazioni sul tipo di trasmissione della patologia nella famiglia in esame per individuare per esempio forme recessive, dominanti o sporadiche. I soggetti selezionati sono stati poi sottoposti ad un indagine genetica per mutazioni contenute nei principali geni identificati come i maggiori responsabili di ipoacusie neurosensoriali non sindromiche. Per realizzare tali indagini genetiche è stato effettuato un prelievo di sangue o di saliva dal quale è stato estratto il materiale biologico necessario (DNA). Tutti i soggetti sono stati informati, tramite consenso informato, delle eventuali procedure clinico-strumentali a cui si sono sottoposti e di tutti i passaggi previsti 19

20 4.2-Analisi strumentale Su ciascun componente è stato eseguito un esame audiometrico tonale. L audiometria tonale è importante per quantificare e identificare il tipo di perdita. I segnali acustici usati sono dei toni puri generati dall audiometro, strumento che consente di conoscere, oltre alla frequenza, anche l intensità del suono che viene inviato al soggetto. L esame viene realizzato in una in una cabina silente (Figura.5). Figura 5-cabina silente Al paziente vengono sistemate le cuffie necessarie per esplorare la via aerea e viene inviato un tono puro ad un intensità tale da essere avvertito dal paziente in modo chiaro. Si diminuisce quindi l intensità del tono di 10 decibel in 10 decibel finchè non viene piu avvertito dal paziente. Quindi lo si aumenta di 5 in 5 finchè non viene percepito di nuovo e si rinvia lo stimolo per confermare la risposta: tutto cio permette di individuare la minima intensità percepibile dal paziente. Le frequenze esplorabili con la via aerea sono:

21 Hz. Dopo aver esaminato separatamente le due orecchie si passa al rilevamento della soglia per via ossea; il procedimento è lo stesso ma in questo caso le cuffie vengono sostituite con un vibratore per conduzione ossea che viene applicato sulla mastoide corrispondente all orecchio da esaminare, il vibratore viene sostenuto da un archetto di acciaio. Le frequenze testate con la via ossea sono: Hz. I risultati ottenuti vengono riportati su un audiogramma. Per un inquadramento completo audiologico, oltre al test dell audiometria tonale tutti i soggetti sono stati sottoposti ad esame impedenzometrico e vestibolare. Per impedenzometria si intende la misura dell impedenza acustica cioè dell impedimento offerto dalle strutture dell orecchio al passaggio del suono e si puo effettuare solo dopo aver verificato l integrità della membrana timpanica e l assenza di eventuali tappi di cerume. Misurando i cambiamenti di questa impedenza propria del sistema si possono raccogliere informazioni sulla funzionalità delle strutture timpaniche e verificare quindi le condizioni dell orecchio medio. L impedenzometria puo essere suddivisa in: statica e dinamica. A sua volta quella dinamica è scomposta in timpanometria e riflessologia ed è quella che fornisce i dati piu significativi 21

22 nell esame clinico. Per un corretto svolgimento dell esame impedenzometrico è necessario inserire nel condotto uditivo esterno (c.u.e.) una sonda contenente tre tubicini: il primo è collegato a un generatore di frequenza fissa detto tono sonda (220 Hz) che convoglia il suono al c.u.e.; il secondo tubicino è collegato ad un microfono che capta e traduce il livello di pressione sonora in corrente continua; il terzo tubicino è collegato ad una pompa e ad un elettromanometro mediante il quale è possibile variare le pressioni nel c.u.e e quindi deformare artificialmente le condizioni di rigidità del sistema timpano-ossiculare (figura 6). Figura 6-schema di un impedenzometro E fondamentale la perfetta tenuta della sonda nel c.u.e.. Come già detto, le informazioni piu importanti sono fornite dalla timpanometria che consiste nella valutazione dell impedenza acustica in funzione delle variazioni pressorie artificiosamente create nel c.u.e. e dalla 22

23 reflessologia che studia le variazioni di impedenza provocate dalla contrazione dei muscoli dell orecchio medio. La valutazione del riflesso viene fatta sia ipsi sia controlateralmente. L esame vestibolare che segue ad un attenta anamnesi, consiste in una serie di prove obiettive e di tecniche strumentali che forniscono informazioni sullo stato funzionale dell equilibrio e permettono di individuare problemi di natura periferica o centrale. Le prove obiettive permettono di individuare segni clinici conseguenti a patologie vestibolari periferiche o centrali presenti spontaneamente o evocati da manovre non strumentali e consistono in: ricerca del nistagmo spontaneo con paziente in posizione seduta, sguardo in avanti e poi lateralizzato a destra e a sinistra (con la stessa procedura viene ricercato anche in posizione supina); prove tonico-segmentarie che permettono di individuare asimmetrie vestibolari o deficit centrali; ricerca del nistagmo di posizionamento mediante la manovra di Dix- Hallpike che ci permette di individuare la vertigine parossistica posizionale del canale semicircolare posteriore; ricerca del VOR ed Head Shaking Test che ci forniscono ulteriori informazioni su un eventuale ipofunzione labirintica. La maggior parte di questi test sono stati effettuati facendo indossare al paziente una maschera collegata ad una telecamera. 23

24 Le tecniche strumentali piu utilizzate sono le prove caloriche che consistono nell introduzione nel c.u.e. di acqua a temperatura diversa da quella corporea, a questa stimolazione consegue una reazione labirintica ed in particolare dei canali semicircolari. L entità della reazione indotta dallo stimolo termico consente di determinare lo stato funzionale dei recettori ampollari ed in particolare di quello del canale semicircolare laterale. 24

25 4.3-Analisi molecolare Per quanto riguarda i soggetti affetti da ipoacusia neurosensoriale, la ricerca delle mutazioni più diffuse in questo tipo di patologia è stata innanzitutto realizzata mediante sequenziamento diretto, analizzando in primo luogo il gene GJB2 (connessina 26). Nei casi in cui viene identificata una sola mutazione (eterozigosi) si procede alla ricerca di mutazioni nel gene GJB6 (connessina 30), nel DNA mitocondriale e all eventuale presenza delle due delezioni (del GJB6-D13S1830 e del GJB6-D13S1854) a monte del gene GJB6 recentemente identificate come causa di ipoacusia (5) Nel caso di identificazione di mutazioni nuove, prima di attribuire all alterazione molecolare un significato patologico è necessario realizzare le verifiche universalmente note nel campo della ricerca (escludere che non si tratti di un polimorfismo, segregazione con la patologia, saggi per la verifica di funzionalità, etc.). Per tutti i soggetti, affetti da una forma familiare di ipoacusia neurosensoriale in cui non verranno identificate mutazioni nei suddetti geni si cerca di realizzare un analisi di linkage genetico per individuare il locus contenente il gene responsabile della patologia. 25

26 Capitolo V Risultati L indagine è stata eseguita su soggetti affetti da ipoacusia neurosensoriale non sindromica; dai soggetti analizzati sono stati selezionati 191 pazienti tutti di origine Campana tranne 8 Tra i 191 soggetti selezionati e analizzati, sono stati individuati: -54 soggetti appartenenti a famiglie con modalità di trasmissione autosomica recessiva; -27 soggetti appartenenti a famiglie con modalità autosomica dominante; -110 soggetti sporadici 5-1Analisi mutazionale I soggetti selezionati sono stati innanzitutto sottoposti ad analisi molecolare per il gene GJB2 che codifica per la connessina 26. Sono stati identificati 24 soggetti omozigoti per la delezione 35delG, di cui 14 soggetti sporadici ed i rimanenti 10 appartenenti al gruppo degli autosomici recessivi. La percentuale di omozigoti nel gruppo dei 191 pazienti risulta quindi di 12.5% (24/191). 26

27 Prendendo in considerazione solo i casi sporadici e familiari recessivi (164 soggetti), la percentuale di omozigoti risulta di 14,6%, mentre considerando solo i casi con trasmissione autosomica familiare recessiva (54 soggetti) la percentuale degli omozigoti risulta essere 44%. Dei 24 soggetti omozigoti identificati, 2 presentano un ipoacusia di grado moderato con una perdita compresa tra i 41 e i 70 db; tre presentano un ipoacusia di grado severo con una perdita compresa tra 71 e 95 db; 19 presentano un ipoacusia di grado profondo con una perdita superiore a 95 db. Nessun soggetto presenta ipoacusia di grado lieve (21-40 db). Il tipo di ipoacusia è congenito e non progressivo: sono tutti soggetti giovani con età inferiore ai 32 anni e non c è correlazione tra il tipo di perdita uditiva e l età. (Tabella 1 e Figura 7). 27

28 Omozigoti 35delG Sigla soggetto A G A A G A A G A G O G G A A85A G O A G A G G A O Tabella 1. Perdite uditive dei soggetti omozigoti 35delG 28

29 db HL Omozigoti 35delG Frequenza (Hz) A01 G08 A129 A10 G19 A18 A115 G24 A23 G26 O1 G28 G32 A77 A85A G36 O2 A134 G41 Figura 7. Curve audiometriche dei soggetti omozigoti 35delG Tra i soggetti presi in esame 8 individui sono risultati doppi eterozigoti per la 35delG su un allele ed un altra mutazione sull altro allele, tra cui 2 sporadici e 6 recessivi. (Tabella 2 e Figura 8). Considerando tutti i soggetti (191) la percentuale di doppi eterozigoti è del 4,1%, considerando solo i casi sporadici e recessivi (164) la percentuale risulta del 4,8%. 29

30 Doppia eterozigosi 35delG/Altro Età Mutazione Codice soggetto anni 35delG/167delT A delG/del 14 anni E120 A anni 35 delg/e47x A anni 35delG/W77R A anni 35delG/L90P A anni 35delG/Y65X A anni 35delG/R127H A anni 35delG/G12V A Tabella 2. Perdite uditive e mutazioni identificate nei soggetti doppi eterozigoti 35delG/altro. Doppia eterozigosi 35delG/altro 0 Frequenza (Hz) db HL A17 A79 A83-1 A125 A25-1 A37 A46 A Figura 8. Curve audiometriche dei soggetti doppi eterozigoti 35delG/altro. 30

31 Il soggetto A46 (mutazione R127H), l unico che presenta un ipoacusia di tipo profondo è di origine non campana. Tale mutazione non è stata riscontrata in nessun altro soggetto esaminato. Sono stati individuati 2 soggetti doppi eterozigoti non 35delG tra cui 1 recessivo e 1 sporadico (2/191=1%; 2/164=1,2%) (Tabella 3 e Figura 9). Doppia eterozigosi non 35delG Sigla età mutazione soggetto anni V27I/F83L A anni V153I/L90P A Tabella 3. Perdite uditive e mutazioni identificate nei soggetti doppi eterozigoti non 35delG. Le mutazioni V27I ed F83L sono state riscontrate solo nel soggetto A67 anch esso di origine non campana. 31

32 Doppia eterozigosi non 35delG 0 Frequenza (Hz) db HL A67 A Figura 9. Curve audiometriche dei soggetti doppi eterozigoti non 35delG. Sono stati individuati 7 soggetti con una singola eterozigosi 35delG, 5 recessivi e 2 sporadici (Tabella 4 e Figura 10); considerando tutti i soggetti in esame, la percentuale di individui con questa caratteristica è del 3,6%; considerando solo i casi sporadici e recessivi, la percentuale è del 4,2%. 32

33 Singola eterozigosi 35 delg Sigla soggetto G58-II A A A Tabella 4. Perdite uditive nei soggetti con singola eterozigosi 35delG. Singola eterozigosi 35delG db HL Frequenza (Hz) G58-II-1 A56 A71 A90 Figura 10. Curve audiometriche dei soggetti con singola eterozigosi 35delG. Ancora, tra i 191 soggetti ne sono stati identificati 10 con singola eterozigosi non 35delG tra cui 3 con familiarità recessiva e 5 sporadici (8/191=4,1%; 8/164=4,8%) (Tabella 5 e Figura 11) e 2 33

34 individui appartenenti a famiglie con trasmissione autosomica dominante. Le variazioni nucleotidiche riscontrate in questi ultimi due soggetti non sono riportate in letteratura e devono essere sottoposte a vari test (come riportato in materiali e metodi) per essere classificate come mutazioni causative della sordità. Singola eterozigosi non 35delG Mutazione Sigla soggetto c579dela A36-C V37I A V153I A V153I A G160S A L90P A V153I A L90P A Tabella 5. Perdite uditive e mutazioni identificate nei soggetti con singola eterozigosi non 35delG. 34

35 Singola eterozigosi non 35delG 0 Frequenza (Hz) db HL c579dela A36-C V37I A26 V153I A54 V153I A97 G160S A130 L90P A138 V153I A139 L90P A Figura 11. Curve audiometriche dei soggetti con singola eterozigosi non 35delG. I soggetti con mutazione su un singolo allele sono stati analizzati anche per la ricerca di mutazioni nei geni GJB6 (analizzando la presenza delle due delezioni a monte di tale gene, riportate in letteratura come causative di ipoacusia) e nel DNA mitocondriale (gene 12S ribosomiale). Per tutti i soggetti esaminati non è stata identificata alcuna mutazione né nel gene GJB6, né nel DNA mitocondriale. L unica eccezione è rappresentata da uno dei soggetti, sopra citati, con ipoacusia a 35

36 trasmissione autosomica dominante che presenta anche una singola eterozigosi per una nuova variazione nucleotidica nel gene GJB2. Tale soggetto presenta infatti una nuova variazione nucleotidica nel DNA mitocondriale. Anche per tale variazione sono in corso test funzionali biologici. Inoltre è stato identificato un soggetto (sporadico) con un nuovo polimorfismo (c185t). Per i rimanenti soggetti non è stato possibile, al momento, identificare con certezza una causa genetica. Nella Tabella 6 e Figura 12 sono riportati i valori audiometrici ed i corrispondenti audiogrammi di un campione di 22 soggetti sporadici e con trasmissione familiare recessiva. 36

37 Idiopatici Sporadici/Fam. Rec. :gene non identificato G A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A G A A A A G G A Tabella 6. Perdite uditive identificate nei soggetti idiopatici sporadici e familiari recessivi per cui non è stato identificato il gene. 37

38 db HL Idiopatici Sporadici/Fam. Recessivi:gene non identificato Fraquenza (Hz) G10 A04 A05 A13 A16 A20 A21 A28 A39 A49 A64 A68 A104 A106 A118 Figura 12. Curve audiometriche nei soggetti idiopatici sporadici e familiari recessivi per cui non è stato identificato il gene. Le perdite uditive di tali soggetti, al contrario di quanto mostrato nella Figura 7, in cui erano riportate quelle dei soggetti omozigoti 35delG, mostrano una grande variabilità riguardo al tipo di ipoacusia (da lieve a profondo). 38

39 Conclusioni e Discussione La sordità è una patologia largamente diffusa nella popolazione. Attualmente però, per molti soggetti l eziologia rimane sconosciuta; a tal fine, in questo lavoro di tesi sono stati analizzati soggetti prevalentemente di origine Campana. I soggetti sono stati analizzati da un punto di vista audiologico e genetico per la ricerca delle mutazioni nei geni attualmente identificati come i maggiori responsabili delle ipoacusie neurosensoriali non sindromiche. Il contributo del gene GJB2 nelle sordità neurosensoriali non sindromiche varia in diverse popolazioni e questa eterogenità genetica è enfatizzata anche dalla variazione della frequenza di specifiche mutazioni tra le diverse popolazioni. La frequenza della mutazione 35delG da conto di circa il 70% degli alleli mutati nel Nord- Sud Europa. La frequenza della 35delG è ancora più alta nei paesi vicino al Mediterraneo. Nei soggetti esaminati in questo studio la percentuale degli alleli mutati (35delG) risulta essere di circa 75% (60/80). Considerando solo i soggetti con origine Campana la percentuale è di 78 % (60/76). I risultati ottenuti confermano l importanza del gene GJB2 nelle sordità neurosensoriali. Nel campione Campano esaminato inoltre non sono state riscontrate mutazioni nel gene GJB6 e nel DNA 39

40 mitocondriale, ad eccezione di una nuova variazione nucleotidica, la cui importanza nella insorgenza della sordità deve ancora essere valutata. La frequenza di mutazioni in tali geni nel Sud Italia, attualmente è riportata intorno al 1.9%. Per le altre mutazioni identificate nella zona codificante del gene GJB2, si può riscontrare che le mutazioni più frequenti sono la V153I (5 alleli) e la L90P (4 alleli) Per quanto riguarda la correlazione genotipo-fenotipo, diversamente da come riportato in letteratura (24) in cui si evidenzia una distribuzione bimodale (moderata e profonda) per le perdite uditive dei soggetti omozigoti, si può invece osservare che nel campione Campano esaminato la distribuzione degli esami audiometrici nei soggetti con omozigosi 35delG (Figura 7) presenta perdite uditive prevalentemente profonde con una percentuale del 79% (19/24). Nei campioni idiopatici ( Figura 12 ) si osserva invece una distribuzione degli audiogrammi molto più ampia. Per le altre categorie non è possibile fare una chiara correlazione genotipo-fenotipo ad eccezione della conferma del dato che per quanto riguarda le ipoacusie a trasmissione autosomica dominante, le perdite uditive sono postverbali e più lievi rispetto a quelle dei soggetti con mutazioni recessive. 40

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44 20) del Castillo I, Moreno-Pelayo MA, del Castillo FJ, Brownstein Z, Marlin S, Adina Q, Cockburn DJ, Pandya A, Siemering KR, Chamberlin GP, Ballana E, Wuyts W, Maciel-Guerra AT, Alvarez A, Villamar M, Shohat M, Abeliovich D, Dahl HHM, Estivill X, Gasparini P, Hutchin T, Nance WE, Sartorato EL, Smith RJH, Van Camp G, Avraham KB, Petit C, Moreno F. Prevalence and evolutionary origins of the del(gjb6-d13s1830) mutation in the DFNB1 locus in hearing impaired subjects: a multicenter study. Am J Hum Genet 2003;73: ) Grifa A, Wagner C, D Ambrosio L, Melchionda S, Bernardi F, Lopez-Bigas N, Rabionet R, Arbones M, Della Monica M, Estivill X, Zelante L, Lang F, Gasparini P. Mutations in GJB6 cause nonsyndromic autosomal dominant deafness at DFNA3 locus. Nat Genet 1999;23: ) Pericak-Vance MA, Barker DF, Bergoffen JA, Chance P, Cochrane S, Dahl N, Exler MC, Fain PR, Fairweather ND, Fischbeck K, et al.: Consortium fine localization of X-linked Charcot-Marie- Tooth disease (CMTX1): additional support that connexin32 is the defect in CMTX1. Hum Hered May-Jun;45(3):

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