Se ho due sostanze con K D diversi, queste si separano, poiché viaggiano in maniera diversa

1 2 ogni estrazione si divide in: -raggiungimento equilibrio delle fasi -separazione completa delle frasi -travaso DV M DV F Se ho due sostanze con K D diversi, queste si separano, poiché viaggiano in maniera diversa

H Questo modello presuppone che la colonna cromatografica contenga un elevato numero di strati, detti piatti teorici, sui quali si instaura l equilibrio di ripartizione dell analita tra fase stazionaria e fase mobile. L analita si sposta verso la fine della colonna attraverso il movimento della fase mobile da un piatto al successivo. E importante sottolineare che i piatti non esistono realmente all interno della colonna, sono solo un modello per facilitare la comprensione del processo che avviene in colonna. > è il N di piatti, > gli equilibri di ripartizione, e > sarà la separazione fra 2 sostanze con diverso K D V M V F N = L/H

Se ho due sostanze A e B, quella che ha maggior solubilità nel solvente organico K D >viaggerà più rapidamente, cioè uscirà per prima dall'ultimo recipiente e si separa dall'altra. Facendo un grande numero di estrazioni nei primi recipienti non rimane praticamente nulla con n estrazioni la massima quantità sarà in r. Con n>r posso raccogliere tutto in uscita

Cromatografia La nascita della cromatografia si deve al botanico russo Mikhail Semenovich Tswett, che per primo la utilizzò nel 1903 per separare i pigmenti naturali contenuti inestratti vegetali. Mikhail S. Tsvett (1872 1919) 4

Fase Stazionaria o Fissa (FS o FF) carbonato di calcio Fase Mobile (FM) o eluente etere di petrolio, un solvente organico composto da idrocarburi a basso punto di ebollizione.

Tswett chiamò questa tecnica cromatografia dal greco scrittura del colore o, visto il significato del suo cognome in russo, scrittura di Tswett Separazione di caroteni, clorofille e xantofille sulla base della loro affinità per la fase stazionaria e la fase mobile 6

CROMATOGRAFIA Il termine cromatografia racchiude una serie di metodi analitici in grado di separare, identificare e quantificare singolarmente i diversi componenti presenti in miscele di analiti anche molto complesse I metodi cromatografici sfruttano la diversa affinità delle molecole e degli ioni nei confronti di due fasi diverse immiscibili fra di loro: la fase fissa o stazionaria (FF o FS) e la fase mobile (FM) FM FF FM B A I diversi componenti sono separati in funzione delle diverse velocità con cui sono trasportati attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile

Basi del procedimento cromatografico Il campione è iniettato in colonna e trasportato dalla fase mobile, che può essere un gas, un liquido o un fluido supercritico. La fase mobile viene fatta eluire in continuo attraverso la fase stazionaria, che deve essere immiscibile nell eluente. La fase stazionaria (liquida o solida) si trova all interno di una colonna oppure è supportata su una superficie piana. La separazione dei componenti di una miscela avviene a seguito delle interazioni chimico-fisiche che avvengono fra le molecole da separare con la fase fissa e la fase mobile. La fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi. Dal momento che le diverse molecole interagiranno in maniera diversa con la fase stazionaria i componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema i componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocemente La separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una distribuzione caratteristica tra le due fasi (costante di ripartizione K D =C m /C s )

Visualizzazione della separazione Ponendo all uscita della colonna un rivelatore che misuri la concentrazione del soluto nell eluato (cioè la fase mobile che esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo si può ottenere un cromatogramma La posizione dei picchi sull asse dei tempi, o tempo di ritenzione, serve per identificare i componenti del campione L area sottesa dai picchi è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo

Interazione soluto-fasi Le interazioni che si verificano fra i soluti e le due fasi, stazionaria e mobile, sono deboli. Se non questo non avvenisse non ci sarebbe o eluizione o ritenzione da parte della fase stazionaria. Le interazioni che si stabiliscono sono: - legame idrogeno -forze di Van der Waals -interazioni dipolo-dipolo -interazioni dipolo-dipolo indotto -interazioni dipolo indotto-dipolo indotto -interazioni coulombiane -interazioni steriche

CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI GASCROMATOGRAFIA LIQUIDA GC (FM gas) CROMATOGRAFIA LC HPLC (FM liquida) GSC FF solido adsorbente GLC FF liquida LSC LLC IEC SEC FF solido liquido resina gel TLC PC HPLC MW o PM crescenti GC (gaschromatography) gas (GSC) o liquidi volatili (GSC E GLC) LSC (liquid solid chromatography) molecole non grandi, non troppo trattenute e non polari LLC (liquid liquid chromatography) di uso generale, moleole medio grandi e PM medio IEC (ion exchange chromatography) anioni e cationi sia organici che inorganici SEC (size exclusion chromatography) macromolecole, proteine, polimeri

1898-1903 D. Trebot Day, geologo americano, separò alcuni idrocarburi utilizzando colonne di farina fossile. 1903-1906 M. Tswett, botanico russo, separò una serie di pigmenti colorati presenti in un estratto di foglie verdi utilizzando CaCO3 ed etere di petrolio; coniò anche il nome cromatografia che significa "scrittura mediante ilcolore". 1930-1931 R. Kuhn e E. Lederer utilizzarono la cromatografia per la separazione di carotenoidi e xantofille. 1938 N.A. Izmailov e M.S.Shaiber descrissero per la prima volta la cromatografia su strato sottile 1941 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge presentarono il primo lavoro sulla cromatografia di ripartizione. Essi introdussero la teoria dei piatti basata su di un'analogia con la teoria della distillazione e dell'estrazione controcorrente. 1952 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge ebbero il premio Nobel per la chimica per lo sviluppo della cromatografia di ripartizione gas-liquido. 1956 J.J.van Deemter sviluppò la teoria della separazione cromatografica. 1958 E.Stahl mise a punto la tecnica della cromatografia su strato sottile. 1966 Inizia lo sviluppo della moderna tecnica della cromatografia in fase liquida ad alta prestazione.

Esempio: separazione di tre composti in un colonna con fase stazionaria solida. Ogni componente X si distribuisce fra la FS e la FM in accordo al suo K D X M X S K D = [X M ]/ [X S ] K D =Xm/Xs Quale componente ha K D maggiore?

Parametri caratteristici di un cromatogramma Il tempo necessario alle molecole della FM per attraversare la colonna è detto tempo morto T M. Soluti che non interagiscono con la FF non sono trattenuti dalla colonna, ma viaggiamo con la FM e vengono rilasciati dalla colonna con un tempo pari al T M. Il primo picco visualizzabile sul cromatogramma ci dà indicazioni sul T M. Il tempo T R é il tempo necessario ad un componente introdotto nel sistema cromatografico ad essere eluito dalla colonna. Dipende dalle interazioni che si stabiliscono fra soluto-ff e soluto-fm T R è f (soluto, fase fissa, fase mobile, T) Dà importanti informazioni nell analisi qualitativa

R V RM V RA V RB V R Velocità di Flusso o portata

Velocità di Flusso o portata V RS VRA R V RM V R

Un soluto che si muove attraverso la colonna cromatografica tende ad espandersi in forma approssimativamente gaussiana con deviazione standard s. L equazione che descrive un picco gaussiano è: y = Isoterma lineare s 1 ( x ) 2 2 s e 2 2 C s Segnale Tempo IDEALE C m

FATTORE DI ASIMMETRIA DI UN PICCO L asimmetria (A s ) dei picchi è dovuta alla deviazione del K D = C M /C S dei soluti e può essere così indicata A s = b = a < > 1 h a b 10% h symmetric A s = 1,0 tailing A s > 1,0 fronting A s < 1,0 Giorgio Bonaga

Sovraccarico per iniezione di troppo soluto: la banda emerge gradualmente dalla colonna, ma termina bruscamente Alcuni siti della fase stazionaria trattengono il soluto più fortemente di altri: si origina così una codatura prolungata

Maggiore è il tempo impiegato da un soluto per attraversare la colonna e più larga sarà la banda. Le comuni misure della larghezza sono: w 1/2 = larghezza a metà altezza e w = larghezza all intersezione della linea di base con le tangenti tracciate lungo le parti più ripide del picco Due fattori contribuiscono a determinare la qualità della separazione di 2 componenti: Differenza fra i tempi di eluizione dei picchi (più sono distanti, migliore è la separazione) Larghezza dei picchi (più sono larghi, peggiore è la separazione) N numero piatti teorici N=L/H Altezza del piatto piccola N=L/H=Lx/s 2 = L 2 /s 2 H = s Picchi stretti 2 x Migliori separazioni L Altezza del Piatto Teorico è la costante di proporzionalità tra la varianza della banda (s 2 ) e la distanza che essa ha percorso (x)

1) Altezza equivalente di piatto teorico H 2) Numero di piatti teorici N L = lunghezza colonna Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una singola separazione, N ha un significato puramente matematico. Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione (migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna. R N = t s N 2 tr = 16 W W 2 L altezza equivalente al piatto teorico (H = L/N) consente di confrontare l efficienza di colonne di differente lunghezza. N = L H 25

CALCOLO del NUMERO DI PIATTI TEORICI N=n dei piatti w= width o base del picco w h = b ½, mentre w b = b N=(V R \s V ) 2 =(t R \s t ) 2 = (d\s d ) 2 =n adimensionale w h =2.354 s s=w h \2.354 --------------- N=(2.354d\ w h ) 2 5.54(d\ w h ) 2 = 5.54(tr\b ½ ) 2 ---------------- w b =4s > s=w b \4 N=(4d\ w b ) 2 16(d\ w b ) 2 = 16(d\b) 2 ------------ w=5s > s=w\5 N=(5d\ w ) 2 25(d\ w ) 2 = 25 (d\b) 2 ------------- METODO DELLA META ALTEZZA METODO DELLA TANGENTE METODO DEL 5s ------------ N=(2d\ w i ) 2 4(d\ w i ) 2 METODO DEL 2s o 0.607 ------------- PIATTI TEORICI per una stessa colonna diversi a seconda del metodo usato per la misura, ma stesso ordine di grandezza. Es: 5s 82847 piatti per metro tangente 93767 piatti per metro metà altezza 88140 piatti per metro

Risoluzione cromatografica La possibilità di separare due o più sostanze è descritta dal parametro detto risoluzione, che misura la capacità di un sistema cromatografico di separare due analiti con caratteristiche simili: 2 (tr ) R = W A B (t + W Se la risoluzione non è sufficiente (R < 1), i due picchi non possono essere quantificati in maniera corretta R B ) A 2DZ = W + W A B 30

R = 1 4 N a 1 k I a k B I B + 1 Effetto della selettività, dell efficienza e del fattore di capacità sulla risoluzione risoluzione scarsa picchi non separati buona risoluzione dovuta a buona efficienza picchi stretti buona risoluzione dovuta a buona selettività picchi distanti risoluzione scarsa dovuta ad un basso fattore di capacità 31

Riassumendo La selettività quantifica l entità della separazione fra due specie: riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (t R ) B > (t R ) A. Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di k. M A R M B R A B t t t t k k = = ) ( ) ( ' ' a 1 k k 1 N 4 1 R I B I B + a a = A B R R t t ' ' = a A B M A t t k R ' '= A A A A B B B

CARATTERISTICHE PRINCIPALI DEL PROCESSO CROMATOGRAFICO 1) MIGRAZIONE DIFFERENZIALE (dei soluti) 2) ALLARGAMENTO DELLA BANDA CROMATOGRAFICA (del singolo soluto) dipende dagli equilibri di distribuzione dei diversi composti fra FF e FM. a)percorsi multipli b) diffusione longitudinale c)trasferimento di massa in fase mobile in fase mobile stagnante in fase stazionaria a) percorsi multipli o effetto Eddy (importanti in LC e GSC ) impaccamento non uniforme in dimensioni e porosità di FF. b) diffusione longitudinale (importante in GC) Diffusione in direzione parallela all asse della colonna. Le molecole di soluto tendono a diffondere dalle zone ad alta conc. verso quelle a < conc. D è prop. a 1\F c) trasferimento di massa

c) trasferimento di massa c 1 ) trasferimento di massa in fase mobile : il flusso all interno della colonna può essere turbolento o laminare. Il fluido adiacente alla FF si muove lentamente, quello al centro velocemente. Il soluto adiacente alle fase di fase stazionaria percorre una distanza < di quello al centro della corrente. Allargamento c 1 prop a v flusso FM; > v fusso >differenze velocità fra centro e periferia. c 2 ) trasferimento di massa in fase mobile stagnante: la FF è porosa e la FM entra nei pori e ristagna e con essa il soluto che ritarda. c 2 prop a v flusso FM c 3 ) trasferimento di massa in fase stazionaria: le molecole di soluto possono penetrare in fase stazionaria più o meno profondamente. Quelle che penetrano ed interagiscono più a fondo percorreranno una distanza < in colonna c 3 prop a v flusso FM >dimensioni particelle > allargamento banda > è il coeff. Diffusione in fase stazionaria, < il ritardo molecole

La migrazione differenziale è la base della separazione cromatografica: infatti senza differenza nella velocità di migrazione fra i soluti non vi sarebbe alcuna separazione. La migrazione differenziale dei soluti deriva dai diversi equilibri di distribuzione ed interazioni fra i soluti stessi con la fase stazionaria e mobile K, K D, T R, V R Al concetto di migrazione differenziali dei soluti è strettamente legato il concetto di selettività della colonna

MOLTEPLICITA DEI CAMMINI EDDY DIFFUSION H ed = 2 λ d p λ è una misura della non eguaglianza dei flussi. NB: vale solo per le colonne impaccate

DIFFUSIONE LONGITUDINALE Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa velocità. Idealmente iniziano il loro percorso come banda stretta, ma poi la loro dispersione provoca un profilo Gaussiano. Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la velocità media delle molecole Una delle principali cause dell' allargamento della banda cromatografica è la Diffusione, dovuta al flusso della sostanza da una zona a massima concentrazione verso una zona a minima concentrazione in direzione parallela all asse della colonna

Trasferimento di massa 39

Quando la sostanza è in FM si muove rapidamente. Le molecole che interagiscono con la FF rimangono indietro rispetto a quelle in FM. Ho resistenza ad instaurare un equilibrio

H min =A+2(BC) 1/2 u min =(B/C) 1/2

Diffusione longitudinale σ md = (2γ m D m t) ½ Ricordando che * N = t r2 /σ t2 = L 2 / σ L2 ; H = L/N = σ L2 /L e t/l =1/u H md = 2γ m D m /u ; H sd = 2k γ s D s /u Dove γ è il fattore di ostruzione, D il coefficiente di interdiffusione e u la velocità lineare

TRASFERIMENTO DI MASSA Colonne impaccate Nella fase mobile H mfd = ω d p2 u/d m ω = fattore di impaccamento d p = diametro delle particelle Nella fase stazionaria H sfd = 2/3(2k /[1+k ] 2 ) (d f2 /D s ) u d f = spessore del film di fase stazionaria Colonne tubolari Nella fase mobile H mfd = (1+6k +11k 2 )d t2 u/96(1+k ) 2 D m d t = diametro del tubo Nella fase stazionaria la formula è come per le impaccate 44