IV Congresso Nazionale: Le Micotossine nella Filiera Agro-Alimentare
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1 IV Congresso Nazionale: Le Micotossine nella Filiera Agro-Alimentare Sviluppi diagnostici nell analisi delle micotossine ANGELO VISCONTI Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA) Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)
2 Metodi analitici per l analisi di micotossine Un metodo analitico per l analisi delle micotossine deve: essere adatto ai programmi di monitoraggio (screening per il controllo qualità dei materiali nella produzione di alimenti / mangimi) consentire il rispetto dei tenori massimi stabiliti dalle normative internazionali (determinazione di micotossine a livelli inferiori ai tenori massimi ammissibili, secondo criteri di accettabilità definiti) permettere e la raccolta di informazioni ioni sull'esposizione umana e animale alle micotossine (studi di valutazione del rischio)
3 Metodi analitici per l analisi di micotossine Metodi Convenzionali (GC, HPLC, ELISA, LC-MS/MS) Metodi Rapidi/Innovativi (dipsticks, LFD, FPIA, immunosensori, NIR,...) Metodi ufficiali / di riferimento /approvati (AOAC International, CEN, USDA-GIPSA)
4 Metodi convenzionali per l analisi di micotossine Metodi cromatografici TLC HPLC (UV, FL, MS, MS/MS) GC (MS, ECD, FID) Immunosaggi ELISA (colorimetrici, fluorimetrici) Adatti principalmente all analisi di screening cross-reattività dell anticorpo interferenze dovute alla matrice possibili falsi positivi/negativi necessità dell analisi di conferma HPLC
5 Metodi rapidi / innovativi per l analisi di micotossine Immunosaggi/immunosensori: - Immunosaggi a membrana (Flow-Through, FIA) - Lateral Flow Devices (LFD) o dipsticks - Immunosaggi basati sulla Polarizzazione di Fluorescenza (FPIA) - Immunosaggi elettrochimici (SPE) - Biosensori basati sulla Risonanza Plasmonica di Superficie(SPR) - Immunosaggi basati sulla tecnologia Luminex (Multi Analyte Profiling) -Array di biosensori Spettroscopia infrarossa (NIR, MIR, FT-NIR) Naso elettronico (MOS) Metodi che utilizzano recettori alternativi (frammenti di anticorpi, peptidi, molecularly imprinted polymers, aptameri)
6 Metodi innovativi sviluppati recentemente presso l ISPA-CNR Metodo UHPLC/PDA per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodi eod LC-MS/MS S e LC-HRMS per la determinazione e e di micotossine libere e coniugate Immunosaggio Multiplex Dipstick per la determinazione di tossine di Fusarium (DON, ZEA, FB1+FB2, T-2+HT-2) Immunosaggio basato sulla Polarizzazione di Fluorescenza per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodo basato sulla Spettroscopia FT-NIR per la determinazione di DON
7 Metodi innovativi sviluppati recentemente presso l ISPA-CNR Metodo UHPLC/PDA per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodi eod LC-MS/MS S e LC-HRMS per la determinazione e e di micotossine libere e coniugate Immunosaggio Multiplex Dipstick per la determinazione di tossine di Fusarium (DON, ZEA, FB1+FB2, T-2+HT-2) Immunosaggio basato sulla Polarizzazione di Fluorescenza per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodo basato sulla Spettroscopia FT-NIR per la determinazione di DON
8 Determinazione delle tossine T-2 e HT-2 in cereali e derivati mediante HPLC/FLD Estrazione (metanolo:acqua + NaCl) Filtrazione (Whatman Nº 4) Diluizione 1:5 (v/v) con acqua, PBS o 4% NaCl Filtrazione (Whatman GF/A) Purificazione mediante colonnina ad immunoaffinità (IMA) Derivatizzazione precolonna (1-AN) Determinazione HPLC/FLD (λ ex. = 381 nm, λ em. = 47 nm) Visconti et al. (25), J. Chromatography A, 175, Lippolis et al. (28), Talanta, 74, Pascale et al. (29), Report FSA No. C356
9 Determinazione delle tossine T-2 e HT-2 in avena e frumento mediante UHPLC/PDA Estrazione (metanolo:acqua + NaCl) Filtrazione (Whatman Nº 4) Diluizione con 4% NaCl, rapporto1:5 (v/v) Filtrazione (Whatman GF/A) Purificazione mediante IMA Nuova fase stazionaria (diametro particellare <2. µm) Vantaggi (miglioramento delle performance): elevata risoluzione; elevata sensibilità; maggiore rapidità; ridotto consumo di solventi. Tempi delle corse cromatografiche ridotti fino a 9 volte Determinazione UHPLC/PDA (λ = 22 nm) Pascale et al. (212), Talanta, 89,
10 Cromatogrammi UHPLC di campioni di avena dopo purificazione con IMA.25.2 Campione esente da contaminazione (a).15 AU.1 HT-2 T Minutes Campione artificialmente contaminato (25 µg/kg HT-2 e 25 µg/kg T-2) HT-2 T-2 (b) AU Minutes Campione naturalmente contaminato (13 µg/kg HT-2 e 497 µg/kg T-2) HT-2 (c) AU.1 T Minutes
11 UHPLC/PDA tossine T-2 e HT-2 in avena e frumento Applicabilità: avena, frumento 25 LOD: 8 µg/kg (T-2 e HT-2) Accuratezza: 91-12% Precisione: 5% Corsa cromatografica: Intervallo di applicabilità: 5 min 8-1 µg/kg (25 ml su IMA) 4-5 µg/kg (5 ml su IMA) UPL LC (µg kg -1 T-2 + HT-2) (µg kg -1 T-2 + HT-2) UPLC ( (a) )28 oats samples r =.9985 y = 1.6x (b) HPLC (µg kg -1 T-2 + HT-2) 19 wheat samples r =.958 y =.88x HPLC (µg kg- 1 T-2 + HT-2) Validazione: Avena FAPAS test material (T2261) 5 giorni consecutivi valore assegnato: HT-2 = 257 µg/kg ( );; T-2 = 164 µg/kg (95-233) valore trovato: HT-2 = 247 µg/kg (CV, 4.8%); ; T-2 = 159 µg/kg (CV, 1.7%)
12 Metodi innovativi sviluppati recentemente Metodi innovativi sviluppati recentemente presso ISPA-CNR presso l ISPA-CNR Metodo UHPLC/PDA per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodi eod LC-MS/MS S e LC-HRMS per la determinazione e e di micotossine libere e coniugate Immunosaggio Multiplex Dipstick per la determinazione di tossine di Fusarium (DON, ZEA, FB1+FB2, T-2+HT-2) Immunosaggio basato sulla Polarizzazione di Fluorescenza per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodo basato sulla Spettroscopia FT-NIR per la determinazione di DON
13 Confronto tra analisi MS/MS e HCD-HRMS Q1 Q2 Q3 Quantifier ion Qualifier ion Selettività Multiple Reaction Monitoring Accuratezza di massa > 5 ppm Full scan HCD (all ion) fragmentation Accuratezza dimassafino a.5 ppm
14 Determinazione di aflatossine, ocratossina A e tossine di Fusarium (DON, ZEA, T-2/HT-2) in prodotti a base di cereali mediante LC-MS/MS o LC-HRMS dopo clean-up con SPE Semola Farina di orzo Farina di avena Crackers e crackers integrali Cereali per colazione Biscotti Estrazione Lattanzio et al. (211), Rapid Commun. Mass Spectrom., 25, acetonitrile/acqua (84:16, v/v) Lattanzio et al. (211), Food Addit. Contam., 28, Filtrazione Evaporazione Ridissoluzione con metanolo/acqua (1/9) Purificazione mediante OASIS HLB (SPE con fase polimerica) Analisi LC-MS/MS Analisi LC-HRMS
15 Cromatogramma LC-MS/MS di un campione artificialmente contaminato di crackers integrali (-) (+) X 5 (+) (-) (+) Livelli di contaminazione (µg/kg) DON AFB DON 3 AFG 2, AFB 2.4 AFG AFB 1 2. HT-2, T-2 2 ZEA 3 OTA 1.2 AFB T-2 ZEA Colonna: Gemini RP18 ( mm, 5 µm) Phenomenex Flusso: 2 µl/min HT Temperatura: 4 ºC AFG AFG OTA Solv A: H 2 O,.5% acido acetico, 1mM AcNH 4 Solv B: CH 3 OH,.5% acido acetico, 1mM AcNH 4 Volume di iniezione: 2µL (1 mg di matrice)
16 Cromatogramma LC-HCD-HRMS di un campione artificialmente contaminato di crackers integrali DON RT: 4.23 RT: RT: RT: Time (min) AFG Time (min) Colonna: Gemini RP18 ( mm, 5 µm) Phenomenex Flusso: 2 µl/min Temperatura: 4 ºC Solv A: H 2 O,.5% acido acetico, 1mM AcNH 4 Solv B: CH 3 OH,.5% acido acetico, 1mM AcNH 4 Volume di iniezione: 2µl (1 mg di matrice) RT: 8.6 RT: Time (min) 1 AFG RT: RT: HT Time (min) Livelli di contaminazione (µg/kg) DON 3 AFG 2, AFB 2.4 AFG AFB 1 2. HT-2, T-2 2 ZEA 3 OTA 1.2 RT: T 2 RT: Time (min) RT: RT: AFB Time (min) RT: 1.51 AFB RT: ZEA Time (min) 1 8 RT: RT: Time (min) RT: RT: OTA Time (min)
17 Performance dei metodi e confronto tra la determinazione LC-MS/MS e LC-HRMS (crackers integrali) Recuperi, % (RSDr %) Livelli di contaminazione i (µg/kg) DON AFG 2 AFG 1 AFB 2 AFB 1 HT-2 T-2 ZEA OTA LC-MS/MS 1 () 11 (6) 16 (5) 85 (1) 12 (6) 17 (2) 18(6) 84 (5) 11 (3) LC-HRMS 14 () 12 (5) 14 (4) 8 (2) 12 (2) 15 (1) 13(1) 85 (1) 93 (2) LOD (µg/kg) LC-HRMS LC-MS/MS DON.3 (+) 29. (-) AFG AFG AFB AFB HT T ZEA OTA.2.1 Effetto matrice SSE % LC-HRMS LC-MS/MS DON AFG AFG AFB AFB HT T ZEA 65 7 OTA SSE = signal suppression/enhancement (pendenza della retta di calibrazione in matrice/pendenza della retta con soluzioni standard)*1
18 Identificazione di T-2 e HT-2 mono-glicosidi frumento e avena Avena naturalmente contaminata da T-2 (246 µg/kg) e HT-2 (68 µg/kg) HT R elative Abunda ance HT 2 glucosides T T 2 glucoside Time (min)
19 C H 3 H (CH 3 ) 2 CHCH 2 COO OH H O CH 2 O H OH H T-2 CH 3 OCOCH 3 OCOCH 3 OH HO OH C H 3 H (CH 3 ) 2 CHCH 2 COOH H O CH 2 CH 3 H O O H OCOCH 3 O OH T2-3-glucoside OCOCH 3 C H 3 H H (CH 3 ) 2 CHCH 2 COO H O CH 2 CH 3 O H OH H OH HT-2 OCOCH 3 OH HO OH C H 3 H (CH H 3 ) 2 CHCH 2 COO H O CH 2 CH 3 O H OH H O O OH HT2-3-glucoside OCOCH 3 H 3 C H H (CH 3 ) 2 CHCH 2 COO H O CH 2 CH 3 O H O OH O OH HT2-4-glucoside OCOCH 3 HO OH OH Lattanzio et al. (212), J. Mass Spectrom, in press
20 Relative Abundance T2 -CH 3 COOH -CH 2 O CH 3 COOH -(CH 3 ) 2 CHCH 2 COOH [T2+H] [T2+NH 4 ] m/z Spettro LC-HCD-HRMS (energia di collisione 1 ev) di tossina T-2 e T2-glucoside in campioni di avena naturalmente contaminati Re elative Abundance T2 glucoside CH 2 O - CH 3 COOH CH 3 COOH (CH 3 ) 2 CHCH 2 COOH glucose [T2-G+NH 4 ] + [T2-G+H] [T2-G+Na] m/z
21 Effetto del processo di panificazione sulla presenza di DON, T-2 e HT-2 e forme coniugate mediante LC-HRMS Semola naturalmente contaminata: SAMPLE 1: DON, 3528 ng/g; HT-2,16 ng/g; T-2, 39 ng/g. SAMPLE 2: DON, 185 ng/g; HT-2, 1329 ng/g; T-2, 11 ng/g. SAMPLE 3: DON, 1486 ng/g; HT-2, 61 ng/g; T-2, 63 ng/g. Estrazione (acetonitrile:acqua, 84:16 v/v) Filtratzione (Whatman Nº 4) RICETTA Purificazione mediante SPE (MYCOSEP 227 Trich) Determinazione LC-HCD HCD-HRMS HRMS Monaci et al. (211), J. Chrom, 1218,
22 Cromatogrammi estratti per DON, T-2, HT-2 e relativi mono-glucosidi [DON+HCOO] A [DON 3 Glu+HCOO] B [HT 2+H] + C [HT 2 Glu+NH 4 ] + D [T 2+NH 4 ] + E [T 2 Glu+NH 4 ] + F
23 Effetto del processo di panificazione sulla presenza di DON e DON-3-glucoside mediante LC-HRMS DON DON3-GLU s.d. * = deviazione standard (n=8)
24 Persistenza Effetto del di DON, processo T-2 di e HT-2 panificazione e forme sulla coniugate presenza nel processo di di produzione T-2/HT-2 e del glucosidi pane mediante LC-HRMS T-2 content (ng /g) HT-2 content (ng/g) T-2 Flour Bread Sample 1 Sample 2 Sample 3 HT2 Wheat samples Flour Bread Pe eak area T-2-GLU Flour Bread 2 1 Sample 1 Sample 2 Sample 3 Peak area 4 HT-2-GLU Wheat samples 7 Flour 6 Bread Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 1 Sample 2 Sample 3 Wheat samples s.d. * = deviazione standard (n=8) Wheat samples
25 Metodi innovativi sviluppati recentemente presso l ISPA-CNR Metodo UHPLC/PDA per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodi eod LC-MS/MS S e LC-HRMS per la determinazione e e di micotossine libere e coniugate Immunosaggio Multiplex Dipstick per la determinazione di tossine di Fusarium (DON, ZEA, FB1+FB2, T-2+HT-2) Immunosaggio basato sulla Polarizzazione di Fluorescenza per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodo basato sulla Spettroscopia FT-NIR per la determinazione di DON
26 Dipstick multi-micotossina Tossine di Fusarium in cereali, prodotti derivati, mangimi a base di mais Prototipo dipstick multimicotossina: immunosaggio competitivo indiretto linea controllo FB1-BSA DON-BSA T2-BSA ZEA-BSA linea controllo FB1-BSA DON-BSA T2-BSA ZEA-BSA campione NEGATIVO Anticorpi marcati Campione NEGATIVO linee test più scure della linea di controllo
27 Dipstick multi-micotossina Tossine di Fusarium in cereali, prodotti derivati, mangimi a base di mais Prototipo dipstick multimicotossina: immunosaggio competitivo indiretto linea controllo FB1-BSA DON-BSA T2-BSA ZEA-BSA linea controllo FB1-BSA DON-BSA T2-BSA ZEA-BSA campione POSITIVO Anticorpi marcati Campione POSITIVO Linee Test più chiare della linea di controllo
28 Dipstick multi-micotossina Protocollo di analisi frumento/avena/mais / mangime a base di mais cereali da colazione Campione Negativo Positivo ZEA Positivo ZEA/T2 Positivo ZEA/T2/DON Positivo ZEA/T2/DON/FB1 Diluizione con tampone Lettore di Dipstick (Readsensor) Metanolo/Acqua Blending Differenti fattori di diluizione Incubazione a 4 C Migrazione Tempo totale di (per tutte le micotossine) Condizioni ottimizzate analisi: 3 min
29 Dipstick multi-micotossina Analisi di mais naturalmente a contaminato a o Livelli di cut-off in cereali, prodotti derivati, mangimi a base di mais Livelli di CUT-OFF (µg/kg) fissati al livello target pari all 8% del MRL dell UE ZEA T-2 +HT-2 DON FB 1 +FB 2 FRUMENTO AVENA MAIS MANGIMI A BASE DI MAIS CEREALI DA COLAZIONE A BASE DI FRUMENTO CEREALI DA COLAZIONE A BASE DI MAIS Analisi mediante dipstick di campioni naturalmente contaminati (mais, frumento e avena, n=15) in buon accordo con i risultati dell analisi LC-MS/MS: pochi falsi positivi i (ZEA: 1 avena; T-2/HT-2: 2 1 avena e 1 frumento; DON: 1 mais e 1 avena; FBs: nessun falso positivo) nessun falso negativo Lattanzio et al. 212, Analytica Chimica Acta, 718:99-18
30 Metodi innovativi sviluppati recentemente presso l ISPA-CNR Metodo UHPLC/PDA per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodi eod LC-MS/MS S e LC-HRMS per la determinazione e e di micotossine libere e coniugate Immunosaggio Multiplex Dipstick per la determinazione di tossine di Fusarium (DON, ZEA, FB1+FB2, T-2+HT-2) Immunosaggio basato sulla Polarizzazione di Fluorescenza per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodo basato sulla Spettroscopia FT-NIR per la determinazione di DON
31 Immunosaggi basati sulla Polarizzazione di Fluorescenza(FPIA) ( ) La Polarizzazione di Fluorescenza misura la dimensione di molecole fluorescenti in soluzione P = I v -I h I v + I h I v = Intensità, verticale I h = Intensità, orizzontale P τ= 3ηV RT Rotazione veloce Rotazione lenta basso valore di P elevato valore di P Tracciante fluorescente tracciante-anticorpo
32 FPIA principio base FPIA è un immunosaggio competitivo in fase omogenea Ab Ag Ag-FL Estratti non contaminati Estratti contaminati Rotazione lenta Rotazione veloce Elevato valore di P Basso valore di P Fluoresc cence Polari ization (mp ) P 1 [Ag] P = I v -I h I v + I h [Ag] P è inversamente proporzionale al contenuto di antigene libero in soluzione
33 FPIA T-2 e HT-2 in frumento e avena H1-A1/HT2-FL 1a Norma alized Polarizat tion ormalized Polarization No,9 Estrazione,8,7,6,5,4,3,2,1, 2,5 2,7 2,9 3,1 3,3 Log[T-2 + HT-2] pg ml -1 Estrazione (metanolo:acqua, 9:1 v/v) Diluizione (acqua, rapporto 1:5) [T2 + HT2] ng ml -1 Determinazione FPIA IC 5.54 ±.4 ng/ml Cross-reattività.12 % per NEO Nessuna cross-reattività per DON, NIV, ZEA, OTA, 3-Ac DON, 15-Ac DON. Nessun effetto matrice a 2 mg di matrice equivalente in soluzione
34 FPIA - tossine T-2+HT-2 in frumento e avena Limite i di determinazione (T-2+HT-2) frumento* avena # 8 µg/kg 7 µg/kg Accuratezza (valore medio) 96% (range 5-2 µg/kg) 14% (range 25-1, µg/kg) Precisione 8% 6% Intervallo di linearità 2 12 µg/kg g 12 6 µg/kg g (>12 µg/kg richiesta diluizione estratto) (>6 µg/kg richiesta diluizione estratto) Tempo di analisi 1 min 15 min * Lippolis et al. (211), Anal. Bioanal. Chem., 41, # Dati non pubblicati (attività in corso)
35 FPIA - tossine T-2+HT-2 in frumento e avena FRUMENTO 4 Campioni contaminati (n=45) 35 3 Campioni non contaminati (n=1) 2 AVENA Campioni contaminati (n=47) Campioni non contaminati (n=5) [T-2 + HT-2] µg kg -1 (FP) [ y = 1.12x r =.964 y = 1.12 r = Nessun falso positivo -1 (FP) [T2 + HT2] µg kg y = 1,2661x + 87,552 R² =,9596 r =.9796 y = Nessun falso positivo [T-2 + HT-2] µg kg -1 (HPLC) [T2 + HT2] µg kg -1 (HPLC) Analisi di materiale certificato FAPAS (T2261) T-2 (µg/kg) HT-2 (µg/kg) T-2 + HT-2 (µg/kg) Intervallo di accettabilità ( ) Valore assegnato (421) Valore trovato ± SD* 387 ± 41 * 3 repliche
36 Metodi innovativi sviluppati recentemente presso l ISPA-CNR Metodo UHPLC/PDA per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodi eod LC-MS/MS S e LC-HRMS per la determinazione e e di micotossine libere e coniugate Immunosaggio Multiplex Dipstick per la determinazione di tossine di Fusarium (DON, ZEA, FB1+FB2, T-2+HT-2) Immunosaggio basato sulla Polarizzazione di Fluorescenza per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Metodo basato sulla Spettroscopia FT-NIR per la determinazione di DON
37 Spettroscopia del vicino infrarosso in Trasformata di Fourier - DON in frumento Preparazione del campione Tempo < 5 min Tempo < 2 min Analisi FT-NIR,85,8,75 Assorba anza,7,65,6,55,5,45,4,35,3,25 frumento Dimensione particelle 5 µm Regione NIR 1-4 cm -1 Risoluzione 8 cm -1 Scansioni 128/campione, Numero d onda (cm -1 ) Calibrazione (valore misurato vs previsto) 4 Validazione (capacità di predizione del modello) Analisi Quantitativa Analisi Qualitativa Partial Least Squares Linear Discriminant HPLC/UV Regression (PLS) Analysis (LDA) De Girolamo et al. 29, Food Add Contam., 26(6):
38 Analisi quantitativa (PLS) del metodo FT-NIR DON in frumento Buona correlazione tra valori misurati e previsti (calibrazione) µg/kg] (FT-NIR) [DON, Predizione approssimata di campioni incogniti (validazione) r 2 calibration qualità della correlazione calibration q r 2 validation capacità predittiva r discriminazione tra livelli alti/bassi r predizione quantitativa approssimativa Calibration set Validation set r 2 r >.91 buona predizione eccellente predizione [DON, µg/kg] (HPLC) Parametri PLS Calibrazione Validazione N. di campioni Intervallo (µg/kg) < 5 15,84 < 5 15,66 Pendenza Coefficiente di determinazione (r 2 ) RMSE (µg/kg) 216 (RMSEC) a 227 (RMSEP) b a Root Mean Square Error of Calibration (RMSEC); b Root Mean Square Error of Prediction (RMSEP)
39 Analisi Qualitativa (LDA) DON in frumento Set di calibrazione/validazione Classe A [DON] limite di cut-off Classe B [DON] > limite di cut-off Correct clas ssification (% %) Validazione Class A Class B cut-off DON (µg/kg) Risultati Livelli di cut-off di DON (µg/kg) Correttamente classificati 89% 88% 88% Falsi negativi 7% 11% 9% Falsi positivi 4% 1% 3%
40 Conclusioni Metodo UHPLC/PDA (T2 and HT2) Vantaggi Nessuna derivatizzazione Elevata sensibilità Rapidità (elevato throughput ) Svantaggi Strumentazione costosa Richiesto personale specializzato LC-MS/MS (AFs, OTA, DON, ZEA, T-2/HT-2) 2) Analisi multi-micotossina Elevata sensibilità Strumentazione costosa Richiesto personale specializzato Calibrazione in matrice/standard marcati LC-HRMS Analisi multi-micotossina (AFs, OTA, DON, ZEA, T-2/HT-2, Elevata sensibilità Glucosidi) Analisi retrospettiva Identificazione strutturale Strumentazione costosa Richiesto personale specializzato Calibrazione in matrice/standard marcati
41 Conclusioni Metodo Vantaggi Svantaggi Dipsticks multimicotossina (DON/ZEA/FB1+FB2/T2+HT2) Rapido Nessuna purificazione Facile da realizzare Semi-quantitativo Problemi di interferenze di matrice (falsi positivi) FPIA (T2+HT2) Rapio Nessuna purificazione Facile da realizzare Buona accuratezza Buona precisione Intervalli di linearità relativamente ristretti FT-NIR (DON) Rapido Non distruttivo Pratico Qualitativo/semi-quantitativo Strumentazione costosa Necessità di modelli di calibrazione Necessità di basi di statistica
42 Grazie Michelangelo Pascale Annalisa De Girolamo Veronica M.T. Lattanzio Vincenzo Lippolis Linda Monaci Giuseppe Panzarini Roberto Schena Stefania a Valenzano a Elisabetta De Angelis
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