RT PCR NELLAGENETICA DELLA CELIACHIA

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1 RT PCR NELLAGENETICA DELLA CELIACHIA Dott. Ignazio Brusca U.O. di Patologia Clinica Ospedale Buccheri La Ferla FATEBENEFRATELLI Palermo Direttore d.ssa Stella Maria La Chiusa

2 Complex Disorders are due to the interaction between genetic determinants and environmental factors Genetic Determinants Environmental Factors Gene1 Gene2 Gene3 Gene4 Complex Disorders do not exhibit simple Mendelian inheritance patterns. A number of susceptibility loci may exist for a complex disorder (a susceptibility locus increases the risk of developing the disease but it is not sufficient to produce the disease). Mutations at different susceptibility loci confer a small increase in disease risk (less than 100%): Locus Heterogeneity. Different loci interact to increase disease susceptibility: Gene-Gene Interaction Modifier loci may influence the phenotype of a complex disorder.

3 Celiac Disease : Complex Disorder Wolters VM, Cisca W Am J Gastroenterol 2008;103: Celiac disease: strongly heritable, oligogenic,, but genetically complex. King AL, Ciclitira PJ. Mol Genet Metab Sep-Oct Oct;71(1-2):70-5

4 Principali Loci Genici di Suscettibilità alla malattia Celiaca CELIAC1 Regione genica 6p21 Include i geni di classe II HLA-DQ2 e HLA-DQ8 CELIAC2 Regione genica 5q31-33 Include un cluster di geni per alcune citochine (IL4, IL13, IL5,IL3) CELIAC3 Regione genica 2q33 Include i geni regolatori per i linfociti: CD28, CTL4 e ICOS CELIAC4 Regione genica sul Cromosoma 19p13.1 Include il gene MY09B

5 CELIAC1 Gli aplotipi B8-DR3 DR3-DQ2DQ2 e B18-DR3 DR3-DQ2DQ2 sono risultati associati alla malattia celiaca. Questi aplotipi sono molto diversi tra loro (specificità allelica): l unica sequenza CONSERVATA è quella del DR3-DQ2 DQ2

6 CELIAC1 A. Molecola DQ2 formata da una catena proteica α codificata dall allele HLA-DQA1*0501 e da una catena proteica β codificata dall allele HLA-DQB1*0201 presenti sullo stesso cromosoma parentale (configurazione in cis). B. Molecola DQ2 formata da una catena proteica α codificata dall allele HLA-DQA1*0505 e da una catena proteica β codificata dall allele HLA-DQB1*0202 presenti su cromosomi parentali separati (configurazione in trans). C. Molecola DQ8, formata da una catena proteica β codificata dall allele HLA-DQB1*0302 e da una catena proteica α codificata dall allele HLA-DQA1*03 presenti sullo stesso cromosoma parentale (configurazione in cis).

7 CELIAC1 Regione genica 6p21 Include i geni di classe II HLA-DQ2 e HLA-DQ8 Nella maggior parte delle popolazioni studiate il 90% circa dei pazienti con malattia celiaca presenta l aplotipol DQ2 (a1*0501, b1*0201), il 5-8% dei pazienti presenta l aplotipol DQ8, il 2-5% dei pazienti non presenta nén l aplotipo DQ2 nén l aplotipo DQ8. circa il 20-30% della popolazione generale presenta l aplotipol DQ2 (a1*0501, b1*0201), ma di questi solo il 3% svilupperà la malattia celiaca, la condizione di omozigosi DQ2 è presente in circa il 2% della popolazione europea e in circa il 25% dei pazienti altri geni non-hla contribuiscono allo sviluppo della malattia, come supportato dalla differenza nel rapporto di concordanza tra fratelli HLA identici (30%ca)

8 Soltanto eterodimeri α/β DQ2 (DQA1*05, DQB1*02) e DQ8 (DQA1*03, DQB1*0302) legano peptidi del glutine

9 CELIAC2 Regione genica 5q31-33 Include un cluster di geni per alcune citochine (IL4, IL13, IL5,IL3) Il locus CELIAC2 sul cromosoma 5q31 33 è stato descritto per la prima volta da Greco et al. (2001). Questa regione di 250Kb contiene un cluster di geni per alcune citokine e potrebbe avere un ruolo nella regolazione della risposta immune e nel processo infiammatorio.

10 CELIAC2 Per la MC sono stati analizzati molti probabili geni candidati nella regione 5q31-33 ma nessuna evidenza di associazione è stata definitvamente provata. In questa regione è presente un aplotipo TC (1507C>T e -207G>C) all interno del cluster OCTN associato alla malattia Crohn. Non è stata evidenziata alcuna associazione tra la MC è l aplotipo TC. (Ryan 2004, Curley 2006, Latiano et al 2007).

11 CELIAC3 Regione genica 2q33 Include i geni CTL4, CD28 e ICOS, regolatori linfociti T CTLA4, ICOS, e CD28 sono geni coinvolti nella regolazione dell attività dei linfociti T. CD28 and ICOS (inducible co-stimulator) sono coinvolti nell attivazione delle T-cells. CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) è un regolatore negativo dell attivazione delle T-cells e compete con CD28 per gli stessi recettori, CD80 e CD86.

12 CTLA4, ICOS, e CD28 Potenziali fattori di rischio nelle malattie autoimmuni. CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) type 1 diabetes multiple sclerosis Graves disease L associazione tra malattia celiaca e marcatori genetici all interno di CELIAC3 è stata osservata in diverse popolazioni (Brophy 2006, Van Heel 2005). Alcuni studi tuttavia non hanno confermato una relazione tra variante genetica e malattia (Hunt 2005).

13 CELIAC3 Genetics in coeliac disease Van Heel 2005

14 K Brophy et al. 2006

15 CELIAC4 Regione genica 19p13.1 Include il gene MY09B Genome-wide association studies hanno portato all identificazione di una regione genica significativa nel cromosoma 19 (19p13.1). In questa regione è incluso il gene IXB per la miosina (MYO9B),che, per la sua funzione, si presta ad essere un buon gene candidato (Wolters 2008) MYO9B CODIFICA PER UNA PARTICOLARE MOLECOLA DI MIOSINA COINVOLTA NEL RIMODELLAMENTO DELL ACTINA DEL CITOSCHELETRO E DELLE TIGHT JUNCTIONS DEGLI ENTEROCITI Myo

16 L associazione tra MYO9B e MC proposta da Monsuur (2005) non è stata replicata in studi di associazione in United Kingdom, Spagna, Italia e Scandinavia (Amundsen 2006,Giordano 2006, Nunez 2006, Latiano 2007, Cirillo 2007). Recentemente è stata dimostrata una associazione tra Colite Ulcerosa e varianti di MYO9B (IBD6) suggerendo la condivisione di alcuni geni per la suscettibilità tra le due patologie (Weersma 2008, Wolters 2008)

17 CELIAC4 Giordano 2006 Latiano 2007

18 CCR Chemokine receptor cromosoma 3p21 IL2/IL21 Interleukin-2 and interleukin-21 cromosoma 4q27 IL12A Interleukin-12 cromosoma 3q25-26 IL18RAP Interleukin-18 receptor cromosoma 2q11-12 LPP Lipoma-preferred partner cromosoma 3q28 RGS1 regulator of G-protein signaling 1 cromosoma 1q31 SCHIP1 Schwannomin interacting protein 1 cromosoma 3q25-26 TAGAP T-cell activation GTPase activating cromosoma protein 6q25

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20 . MICA molecules interact with the NKG2D-activating receptor on human NK and CD8 T cells... Villous atrophy in Celiac disease might thus be ascribed to an IEL-mediated damage to enterocytes involving NKG2D/MICA interaction after gliadin- induced expression of MICA on gut epithelium... Hüe S et al Immunity Sep;21(3):367 ;21(3): Increased prevalence of celiac disease without gastrointestinal symptoms in adults MICA 5.1 homozygous subjects from the Campania area. Tinto N et al Dig Liver Dis Apr;40(4):248 ;40(4):

21 Linkage studies Genome Wide Linkage studies Association studies using SNP s Genomewide Association studies Oltre ai geni HLA II, almeno 20 altri geni sembrano essere coinvolti nella suscettibilità alla MC, ognuno con un effetto relativo sul rischio di malattia Geni coinvolti nell immunità innata ed acquisita Geni coinvolti nel mantenimento dell integrità della mucosa intestinale Quanti sono i geni per la suscettibilità alla Malattia Celiaca? Sicuramente molti! Il fattore genetico più importate a tutt oggi è la specificità HLA di classe II

22 Correlated sero-sensitivity sensitivity with Modified Marsh Classification 31% sensitivity for serology 100% sensitivity Rostami, Mulder et al. American J Gastroenterol 1999;94:

23 Tipizzazione HLA when? Come supporto alla diagnosi in pazienti con sierologia negativa Pazienti clinicamente sintomatici Pazienti con quadro istologico intestinale compatibile con celiachia In pazienti con patologie associate a celiachia e con sierologia negativa Anemia Stanchezza cronica Bassa statura Anoressia Epilessia Atassia Alopecia Ipertransaminasemia Abortività ripetuta

24 Tipizzazione HLA when? Per individuare soggetti da controllare nel tempo In gruppi a rischio Malattie autoimmuni Sindrome di Down Sindrome di Turner Sindrome di Williams Nei familiari di I grado

25 .437 Italian children with celiac disease, 834 first- degree relatives, and 551 controls Of patients, 91% carried DQ2 and/or DQ8 heterodimers, 6% only had beta2 chain, 2% was alpha5 positive, and four were DQ2/DQ8/beta2/alpha5 negative Considering 1:100 disease prevalence, we obtained a risk gradient ranging from 1:7 for DQ2 and DQ8 individuals down to 1:2518 for subjects lacking all predisposing factors. The DQB1*02 and DQB1*0302 concurrence (p = 9 x 10(-4)), besides the DQB1*02/*02 homozygosity, had an additional role in disease genetic determination...the CD prevalence rose to 17.6% in sisters, 10.8% in brothers,, and 3.4% in parents.. In the three groups, the subjects carrying high-risk HLA molecules were 57%, 71%, and 58%; among them, 29%, 15%, and 6% respectively had CD Megiorni F et al. Hum Immunol Jan;70(1):55-9

26 ...homozygosis for the DQB1*0201 allele is associated with a higher severity of the histological score (p<0.008). Jores RD et al Scand J Gastroenterol Jan;42(1):48-53 Patients with at least 1 DQB1*02 allele showed more often a typical CD and diffuse histological lesions than did patients in the other groups....ttgab titers are HLA-DQB1*02 dose dependent, with significantly higher levels in homozygous individuals. Nenna R et al. J Pediatr Gastroenterol Nutr Sep;47(3):288-92

27 ..Development of tolerance to gluten seems possible in some patients with CD. Further follow-up will show whether this tolerance is permanent or only a long-term return to latency. This feature may be associated with genetic characteristics, especially with HLA genotypes that differ from DQ2 or DQ8.. Hopman EG et al. Eur J Gastroenterol Hepatol ;20(5):423-9

28 PCR convenzionale Amplificazione del cdna tramite PCR 1. Sequenza di DNA target Tradizionale reazione multiciclica suddivisa in 3 fasi: 1. DENATURAZIONE ( C) 2. DNA polimerasi termostabile (Termophilus aquaticus, Taq polimerasi) 2. ANNEALING ( C) 3. Due primers specifici per la sequenza target (oligonucleotidi di bp) 3. EXTENSION (72 C) 4. dntps

29 Separazione elettroforetica dei prodotti di PCR (ampliconi) Gli ampliconi ottenuti dopo uno specifico numero di cicli di amplificazione Vengono fatti migrare su un gel di agarosio quantità: ad occhio o mediante densitometria

30 In teoria: il numero di molecole prodotte (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n) Il prodotto di PCR dipende da T, numero di copie di template di partenza Resa teorica: 2n l'efficienza della reazione dipende da: P = (2)n T strutture secondarie dell'amplicone lunghezza dell'amplicone interazioni non specifiche (Primer, Dimers)

31 Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede all infinito, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Log[DN A] Esponenzial e Lineare Plateau Prodotto variabile N cicli termici Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

32 Vantaggi 1. Velocità e facilità d uso In poche ore si possono ottenere milioni di copie della sequenza di DNA target 1. Sensibilità Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una singola cellula come template (contaminazione) 1. Robustezza Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di bassa qualità Svantaggi della PCR-end point -tempo (PCR, gelcasting, loading, running, staining, analysis) -endpoint detection -rischi di contaminazione --Tossicità dell Ethidium bromide -sensibilità variabile -basso range dinamico < 2 logs --non automatizzabile --precisione discutibile -risultati non numericamente quantitativi

33 Soluzioni Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale quando il prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è proporzionale al prodotto di PCR La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo,, ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, aumentando l accuratezza l analitica rispetto alla PCR tradizionale "end point"

34 PCR CONVENZIONALE 1. DNA extraction 2. amplification 4. Southern blotting 3. electrophresis Real-time PCR 1. DNA extraction 2. Amplification and quantitative result

35 Real-Time PCR: vantaggi La metodica a sistema chiusa diminuisce la possibilità di contaminazioni Consente un notevole risparmio di tempo ( ultra-rapida (da 2 ore fino a 30 minuti), nessuna fase post-pcr Le analisi di melting consentono una rapida genotipizzazione e l identificazione di mutazioni di resistenza non è influenzata da prodotti aspecifici l'amplificazione può essere monitorata in real-time ampio range dinamico di rilevazione (fino a ) richiede 1000-volte meno RNA rispetto ai saggi convenzionali (3 picogrammi) può mettere in evidenza differenze di appena 2 volte molto specifica, sensibile e riproducibile non molto costosa

36 Real-Time PCR: applicazioni Quantificazione virale Quantificazione dell espressione espressione genica Efficacia della terapia farmacologica Misura dei danni al DNA Controllo di qualità e validazione dei saggi Detenzione dei patogeni Controllo degli OGM Genotyping MRD

37 Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche La PCR real-time si avvale di tre chimiche principali: 1.DNA-binding agents (SYBR Green) 2.Hydrolysis probes (TaqMan, Molecular Beacons, Scorpions) 3.Hybridization probes

38 Metodi di rilevamento della fluorescenza SYBR Green Dual-labeled labeled (TaqMan) Molecular beacons Utilizza una molecola fluorescente aspecifica che si lega al solco minore del dsdna, dando luogo ad emissione fluorescente nel verde (530nm) Oligonucleotide che presenta p all estremità 5 un fluoroforo Reporter (R) ed all estremità 3 una molecola Quencher (Q) vengono digerite durante la fase di elongazione Contengono un fluoroforo (R) e un quencher (Q) alle estremità opposte di un oligonucleotide,, ma non vengono digerite durante la fase di elongazione Scorpion Simile alle molecular probes, con la differenza che al 3 3 terminale del probe vi è una sequenza primer specifica per l estensione del target. Sonde FRET Coppia di oligonucleotidi legati ciascuno ad un fluoroforo accettore al 3 3 della prima sonda e donatore al 5 5 della seconda. In fase di annealing le due sonde si legano al target in posizione tale da rendere possibile il trasferimento di energia di risonanza. Le due sonde non vengono idrolizzate.

39 Molecular Beacons È un oligonucleotide che contiene un fluoroforo (reporter) e un quencher non fluorescente alle estremità opposte, disegnate in modo da essere complementari tra loro in modo da formare una struttura stem- Il loop è complementare loop ad una sequenza all'interno del prodotto amplificato Fluoroforo reporter quencher

40 La vicinanza del quencher al reporter fluorescente impedisce l emissione di fluorescenza Quando il beacon si linearizza Il quencher si allontana fal reporter e quest ultimo può funzionare da fluorocromo

41 Celiac RT PCR Diagene Celiac screen Simultanea rivelazione degli alleli HLA di classe II: DQA1*0201, DQA1*03, DQA1*05, DQB1*02, DQB1*0301/04, DQB1*0302, DRB1*03, DRB1*04, DRB1*07, DRB1*11, Omozigosi per gli alleli DQB1*02 e DQB1*0302

42 A PRACTICAL AND RAPID METHOD FOR HLA DQ2-DQ8 DQ8 GENOTYPING IN CELIAC PATIENTS AND IN SUBJECTS AT-RISK...Methods: 39 patients with CD and 32 first-degree relatives were studied using genetic diagnostic methods manufactured by DiaGene (Palermo, Italy). DNA extracted from both dried and fresh blood was amplified in a PCR program using allele specific primers and visualized on pre-cast agarose gel. A DQ-CD Screen kit was initially used for the identification of DQ2 and/or DQ8 positive samples. Positive samples were then tested with DQ-CD Typing kit for the identification of HLA class-ii alleles (DQA1*0201,*03,*05,( DQB1*02,*0302, DRB1*03,*04,*07) ) and finally a DQ-CD Zygosis test was used for the determination of DQB1*02 homozygosis. Results: All 39 CD patients and 21/32 (66%) first-degree relatives carried the CD- associated HLA antigens. Forty-nine were positive for HLA DQ2 (31 DQ2-DR3, DR3, 11 DQ2-DR7, DR7, 3 DQ2-DR3/DR7, DR3/DR7, 1 DQ2-DR4/DR7, DR4/DR7, 2 DQ2, 1 DQ2-DR4), DR4), 9 for DQ8 (DQ8-DR4), DR4), and 2 for DQ2 /DQ8 (1 DQ2/DQ8-DR3/DR4, DR3/DR4, 1 DQ2/DQ8-DR7/DR4); DR7/DR4); 14/51 (27%) of the DQ2-positive patients were DQB1*02 homozygotes. Conclusions: This new diagnostic method for HLA DQ2- DQ8 typing is practical and reliable, and allows alleles and zygosis identification in a very short time. Bizzaro et al Porto 2008

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48 Celiac Gene Typing DQA1*0201 DQA1*03 DQA1*05 DQB1*02 DQB1*0301/04 DQB1*0302 DRB1*03 DRB1*04 DRB1*07 DRB1*11 DRB1*12 DQB1*02 homozygous status DR3-DQ2/DR11 DQ2/DR11-DQ7 DQ7

49 DQA1*0201 DQA1*03 DQA1*05 DQB1*02 DQB1*0301/04 DQB1*0302 DRB1*03 DRB1*04 DRB1*07 DRB1*11 DRB1*12 DQB1*02 homozygous status Celiac Gene Typing DR3/DR7-DQ2 DQ2 homozygous

50 DQA1*0201 DQA1*03 DQA1*05 DQB1*02 DQB1*0301/04 DQB1*0302 DRB1*03 DRB1*04 DRB1*07 DRB1*11 DRB1*12 DQB1*02 homozygous status Celiac Gene Typing DR4-DQ8

51 Special tanks to: Dr. Giorgio Mancuso Dr. Lavinia Mulè, Dr. Maria Barrale