Seconda lezione 2009: GENOMA UMANO e sua organizzazione

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1 DIAGNOSTICA MOLECOLARE E GENETICA MEDICA Seconda lezione 2009: GENOMA UMANO e sua organizzazione Prof. Massimo Zollo massimo.zollo@unina.it Riceve il venerdi dalle 15:00 alle 16:00 Libri da consultare: Genetica in Medicina (Thompson and Thomson)- Idelson Gnocchi Tom Strachan: Genetica Umana Molecolare UTET Eredita Cummings- II edizione EdiSES Genetica Clinica Andrew Read-Zanichelli STUDENTS AREA: LESSONS IN MEDICAL GENETICS

2 -Cenni di cito-genetica Poliploidie-aneuploide

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4 Mitocondrio. 3X10 9 coppie di basi geni ncrnas coppie di basi e possiede 37 geni cagtactgctagctagtcatgcgactgatgtagctagctatcgtagctgactagtgctgacgactgtcgcttttcttatcgtatg gctagtcgatgtactagctgatcgatctagcagctgatcgtagctagtcgatatgctacgtgctagtcgtatttcgatatctagta gtctactagtcgatcgtagctgactgatcgtagctagtcgtacgatgtagctagctagctgatcgatcgatgtgtattgctagt gtcagtaggtcatgtacgtgctgatgctacgtgtagtttgatgttatgcttagaggctagtgatgtcgttatggcatgagtcatgt gttagtacgatcgtacgtagctagctagctgactgatcgtacgtacgtacgatgctagctagctgactgactgtagtggtagt ggatagtgctttttaatatatatatattatttatgctagtagccgcggatttggggggcattgcagcgggcggggctgctcagtct ggcgcatcacacagccacgatygcatgcttcgatctgctacgacgatcgatccatcgatacgtagcgactatgtcgtcgcag ggtgtagtgatcgtagctagctagctatcgatgctagtgctgctagtcgtagctagctagctgactatttatgcatgtagtgcagt cgagtgtctagctagctagctacgtacgtacgtagctacgtacgtacgatcgtagctactagctatattgctagatcgcgtatt

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8 Cariotipo umano NUMERO DI CROMOSOMI Gorilla= 48 Cane=78 Uomo=46 Rana=26 Mosca=12 Topo=40

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11 Texas red/cpg Verde isotiocianato/replicazione tardiva Nero-sovrapposizione

12 NORMALE TUMORALE

13 AMNIOCENTESI Solo a 16 settimane Prelievo cellule amniotiche 1% induce aborti spontanei Rischio infezioni- Effettuata solo per donne: -Sopra i 35 anni nella donna - Storia di gravidanza con aborti -disordini associati all X -riarrangiamenti cromosomici nei genitori

14 PRELIEVO DA VILLI CORIALI CVS analyses (chorionic Villi sampling) 8-10 settimane Alta sensibilità, poche ore di saggio DIAGNOSI PRENATALE PRECOCE Scoperte cellule del sangue nel liquido amniotico.lo studio è di un team di ricercatori italiani. Speranzaper la cura di malattie genetiche su bimbi ancora in utero. 9Marzo 2009 Blood

15 Poliplodie (corredo cromosomico variato.piu cromosomi) Aneuploidie (cromosoma di una coppia in meno o in piu) ANEPLOIDIE possono essere: 1) legate a cromosomi sessuali 2) legate a cromosomi autosomici

16 Poliplodia avviene per: 1) errore della meiosi durante la formazione dei gameti 2) Eventi anormali al momento della fecondazione 3) Errori nelle mitosi successive alla fecondazione Poliplodia- triploidia Avviene principalmente al momento della fecondazione per di-spermia, 2 spermatozoi una cellula uovo

17 Incompatibilità con la vita: Morte dal secondo al quarto mese di età

18 LA NON DISGIUNZIONE..

19 Gli aborti hanno anomalie cromosomiche (trisomie) Ch.16,21,22

20 TRISOMIA DEL CROMOSOMA 13, sindrome di Patau La sindrome di Patau è una malattia genetica molto rara con frequenza 1/5000, 1/20000 bambini nati, colpendo per lo più femmine. Il cariotipo dell'individuo che ne è affetto presenta tre copie del cromosoma 13 invece delle normali due, per tale motivo questa sindrome viene anche chiamata Trisomia 13. Le anomalie fenotipiche sono numerose: labioschisi e palatoschisi, polidattilia (dita delle mani e dei piedi in soprannummero), occhi piccoli, ritardo psico-motorio, cardiopatia, encefalopatia, anoftalmia, criptoftalmia o ciclopia. La maggior parte degli individui muore entro i primi tre mesi di vita. Terapia: sintomatica. Citogenetica: trisomia 13 primaria, derivata da non disgiunzione meiotica o mitotica; trisomia 13 secondaria, da traslocazione robertsoniana. Provoca danni al sistema nervoso centrale ed all'apparato cardiaco.

21 TRISOMIA CROMOSOMA 18 Sindrome di Edwards La sindrome di Edwards è una malattia genetica rara che si manifesta con una frequenza di 1/3000, 1/8000 dei nuovi nati, prevalentemente femmine, ed aumenta all'aumentare dell'età della madre. Viene anche chiamata Trisomia 18 poiché il cariotipo di questi individui presenta tre cromosomi 18 invece di due. ritardo generale di sviluppo, anche durante la gravidanza 90% dei bambini affetti muore nei primi sei mesi di vita per problemi cardiaci

22 Circa nel 95% dei casi, la causa di questa anomalia genetica è la mancata disgiunzione dei cromosomi che si verifica durante una delle divisioni meiotiche che portano alla formazione dei gameti della madre; ne consegue che lo zigote avrà un assetto di 47 cromosomi, con un cromosoma 21 soprannumerario 1:800 bambini nati alta incidenza??

23 Cause: Meiosi femminile: cellula uovo -In profase I della prima divisione meiotica prima della nascita. L ovocita della donna di 40 anni è rimasto in meiosi I, per 40 anni -interazione embrione utero- aneuplodie rendono positivo l attecchimento impianto dell embrione selezione positiva a 20 anni rischio, 0,05% a 35 anni rischio 1% a 45 anni rischio 3-4%

24 ALTERAZIONI CROMOSOMICHE COMUNI

25 (-) delezioni di parti di cromosomi e malattie associate! 5p- Sindrome Cri-du-chat, anomalie facciali e ritardo mentale 11q- Tumore di Wilms, tratto renale genitourinario 13q- Retinoblastoma (tomore all occhio, altri tipi di tumore, assenza del TS-Rb 15q- Sindrome di Prader Willi- astenia ed accrescimento lento, obesità, attacchi di compulsivi di fame

26 TRASLOCAZIONI ROBERTSONIANE, DOWN sindrome

27 FREQUENZA DELL ANEUPLOIDIE

28 LA NON DISGIUNZIONE, LA DISOMIA UNIPARETALE RUSULTATO: ZIGOTE MONOSOMICO Casi di emofilia legata al cromosoma X Prader Willi e Angelman

29 FMR1 - RITARDO MENTALE (tre basi nucleotidiche ripetute (CGG) La sindrome di Martin-Bell o del cromosoma X fragile (FRAX) è la forma più comune di ritardo mentale dopo la sindrome di Down, in quanto interessa 1:1250 maschi e 1:2000 femmine. Si tratta di una malattia ereditaria causata dall'alterazione di un gene situato nel cromosoma X. Il nome "X fragile" deriva dal fatto che queste alterazioni provocano delle modificazioni nella struttura del cromosoma, che al microscopio presenta una strozzatura in un punto preciso (quello in cui è situato il gene). La FRAX colpisce molto più frequentemente i maschi rispetto alle femmine, dato che queste ultime possiedono 2 copie del cromosoma X.

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31 Velocità di Riassociazione del DNA, ha determinato la presenza di regioni di DNA nel genoma: A, B, C C o t --- valore (Cot) C o = concentrazione iniziale del DNA in moli/nucleotidi/litro t=tempo di riassociazione in secondi ad una certa temperatura del DNA A) DNA in singola copia (60%) B) DNA moderatamente ripetitivo (30%) C) DNA altamente ripetitivo (10%)

32 DOTPLOT-PIPMAKER analyses MOUSE chromosome 3q HUMAN chromosome 1q21

33 DOTPLOT analyses HUMAN chromosome 1q21 HUMAN chromosome 1q21

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36 Seguirà un intervento di una mia assistente.. Che da 3 anni sta studiando una sequenza poi rilevatasi un Alu che ha potenzialità terapeutiche.ma non vi parla della ricerca.. ma di che cosa sono le SINES (Alu) e le LINES (KpnI)

37 Aldo Masullo, Il Mattino Domenica 8 Marzo 2009 nell epoca della conoscenza generalizzata..l UNIVERSITA è la cerniera tra la formazione secondaria e la ricerca scientifica. Se la sua struttura non è adeguata alle sue intrinseche tensioni funzionali-tra didattica-ricerca e cultura di massa e selezione di élite creative, incessante innovazione e continuità da preservare, sviluppo tecnologico e riflessione umanistica, servizio alla società e illimitabile libertà del pensiero-, s inceppa il circolo virtuoso di economia e cultura da cui dipende il vivere civile

38 IL NUMERO DI GENI, AUMENTA CON LA COMPLESSITA DELL ORGANISMO? ~22,000 genes ~26,000 genes ~50,000 genes

39 Assenza di correlazione tra numero di geni e dimensione del genoma negli eucarioti Gene number Genome size (Mb) human mouse chicken xenopus zebrafish fugu ciona fly worm yeast 39

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41 Compattezza di alcuni genomi eucariotici Proprietà del genoma Densità genica (numero medio di geni per Mb) Introni per gene (media) % del genoma occupata dalle ripetizioni intersperse S.cerevisiae D.melanogaster H. sapiens , ,4% 12% 44% Le regioni non-codificanti del genoma concorrono alla complessità genotipica e fenotipica di un organismo.

42 IL GENOMA UMANO

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44 Ripetizioni Intersperse nel Genoma Umano Gli elementi ripetuti interspersi costituiscono cirva il 45% del genoma umano. LINE (Long interspersed nuclear elements) L1, L2, L3 LINE ( ~21% del genoma, ~100,000 copie) SINE (Short interspersed nuclear elements) Alu (~10,7% del genoma, ~1,200, 000 copie) MIR, MIR3 (~3% del genoma, ~500,000 copie) Elementi LTR (Long Terminal Repeats) ERV, MalR (8% del genoma, ~500,000 copie) Transposoni a DNA MER1 (Charlie), MER2 (Tigger), others (2,8% del genoma, ~350, 000 copie) 44

45 LINEs:long interspersed nuclear elements promotore Pol II RNA binding anche endonucleasi ripetizioni dirette Lunghezza: 6-7 kb 3 Famiglie di LINEs: -L1 (attive) possono inserirsi nel genoma ed attivare geni con conseguente insorgenza di malattie -L2 e L3 (inattive) 6-7kb 45

46 Meccanismo di trasposizione degli elementi LINEs 1. Generazione di un trascritto LINE full-length a partire dal promotore. 2. ORF1 e ORF2 vengono tradotte e legano il LINE mrna. orf2 5 orf Il complesso LINE mrna/orf1/orf2 si sposta nel nucleo, dove l attività endonucleasica di ORF2 taglia il dsdna. L estremità libera al 3 (sul DNA) funge da innesco per la retrotrascrizione a partire dal 3 UTR. orf2 5 orf

47 SINEs: short interspersed nuclear elements A B AAAA promotore Pol III Sono elementi non-autonomi Lunghezza: tra 0.1 e 0.4 kb 3 famiglie di elementi SINEs: l elemento Alu, ancora attivo, MIR e Ther2/MIR3, elementi inattivi Gli elementi SINEs non contengono alcuna ORF codificante per una trascrittasi inversa, ma sono in grado di trasporre utilizzando la trascrittasi inversa sintetizzata da altri retroelementi (trasposizione LINEs-dipendente). 47

48 SINEs: short interspersed nuclear elements L elemento Alu, il più comune nei primati, è lungo 0,3kb è presente in circa di copie nel genoma umano e rappresenta quindi oltre il 10% di tutto il genoma sono localizzate a monte o a valle dei geni, negli introni, nelle regioni 5 e 3 non tradotte dell mrna. Sono distribuite uniformemente nel genoma, con un intervallo medio tra bp 48

49 Evoluzione e classificazione degli elementi Alu Gli elementi Alu sono classificati in sottofamiglie che si differenziano per l epoca della loro integrazione nel genoma, dalle più antiche (Sx, J) alle più recenti (Yc1, etc.). 49

50 Meccanismo di retroposizione dell elemento Alu Si pensa che il taglio al sito di inserimento sia opera della L1 endonucleasi Target-primed reverse transcription (TPRT) Il promotore pol III è necessario ma non sufficiente per la trascrizione che richiede anche sequenze fiancheggianti appropriate. La maggior parte degli elementi Alu integrati non è attiva in quanto non viene integrata in un contesto favorevole e muta rapidamente sia nelle sequenze CpG che nella regione ricca in A. da: Batzer and Deininger, Nature Rev. Gen. 3:370380, 2002) 50

51 Danni genomici indotti da Alu Numerose patologie sono provocate dall'integrazione casuale di Alu (Neurofibromatosi, haemophilia, sindrome di Apert, ecc.) o da ricombinazione disuguale (diabete di tipo II, sindrome di Lesch Nyhan, malattia di Tay Sachs, ipercolesterolemia familiare, α-thalassaemia, ecc.). 51

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54 Neurofibromatosi (OMIM ) -Autosomica dominante - Prevalenza 1-5 / presenza di numerosi tumori benigni fibrosi (fibromi) della pelle e del tessuto nervoso. Sindrome di Apert (OMIM:101200) -Autosomica dominante - Prevalenza 1/ nati -facio-craniostenosi e sindattilie ossee e cutanee alle mani e ai piedi -Ritardo mentale -Inserzione di un ALU nel gene FGFR2

55 BRCA1 BRCA1 è un oncosoppressore le cui mutazioni sono associate con il cancro alla mammella È lungo circa 80kb ed il 40% è costituito da elementi Alu L mrna di BRCA1 viene prodotto in 2 isoforme che differiscono nella 5 -UTR e nell espressione. Quello con la 5 -UTR più corta è espresso sia nel tessuto mammario sano che tumorale Quello con la 5 UTR più lunga, dovuta all integrazione di un elemento Alu, è espresso solo nel tessuto tumorale Viene tradotto meno efficientemente poichè l elemento Alu ha una delezione di 60 nt nella left arm.

56 Identificazione Bioinformatica di elementi ripetuti RepBase colleziona gli elementi ripetuti noti in una serie di organismi 56

57 Nel genoma umano ci sono circa il doppio di elementi Alu che nel genoma dello chimapanzee. Ciò significa che forse nello chimpanzee questi elementi sono stati meno attivi!!!