La Genomica in Sanità Pubblica I Convegno Siciliano

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1 La Genomica in Sanità Pubblica I Convegno Siciliano Catania, 18 Dicembre 2014 Nuove tecnologiche nella genomica in sanità pubblica Marco Fichera Università di Catania A.O.U. Policlinico V.E. Catania 1

2 CMA ( chromosomal microarrarray analysis) postnatale Prenatale NGS (Next generation sequencing) Postnatale NIPT (non invasive prenatal testing) Postnatale 2

3 3

4 ARRAY: insieme ordinato di sequenze genomiche, la cui mappatura è nota, fissate ad un substrato solido secondo uno schema ricostruibile. 4

5 Array CGH-SNPs Gli SNPs sono sequenze nucleotidiche che differiscono per la sostituzione di un nucleotide (A, T, C, G) con un altro. Lo SNP per essere definito tale deve avere una frequenza maggiore dell 1% nella popolazione; per uno studio di CGH-SNPs array, maggiore è la frequenza più informativo sarà lo SNPs per l analisi Single nucleotide polymorphism (SNP) basati su «microarray» permettono l individuazione di regioni di omozigosità (HZ) attraverso i marcatori biallelici dispersi in tutto genoma per la rilevazione di UPD e IBD 5

6 CMA nella Disabilità intellettiva Aberrazioni cromosomiche criptiche: 15% - 20% dei soggetti con DI, negativi al FRAXA, al cariotipo ed all analisi subtelomerica, hanno uno sbilanciamento genico. La correlazione genotipo-fenotipo è resa difficile dalla grande variabilità del genoma umano. L interpretazione dei dati di un array è tuttora molto difficile. Alcune CNV rappresentano fattori di rischio ad alta penetranza, altre solo fattori predisponenti a penetranza incompleta e rappresentano un problema emergente in genetica clinica. Negli ultimi anni hanno permesso la definizione di numerose nuove sindromi genomiche, 6

7 Il microarray rimpiazza il cariotipo come primo test nel RM\ACM ASD AJHG 2010: The International Standard Cytogenomic Array Consortium Available evidence strongly supports the use of CMA in place of G-banded karyotyping as the first-tier cytogenetic diagnostic test for patients with DD/ID, ASD, or MCA. G-banded karyotype analysis should be reserved for patients with obvious chromosomal syndromes (e.g., Down syndrome), a family history of chromosomal rearrangement, or a history of multiple miscarriages. 7

8 La diagnosi nella DI Il CMA deve essere eseguito da persone esperte Il laboratorio deve costruire un database interno di CNV ottenuto sulla popolazione locale ( CNV della stessa etnia) Il laboratorio deve operare in stretta collaborazione con i clinici. L accumularsi di dati facilita l interpretazione dei risultati L analisi dei genitori è da considerarsi fondamentale L analisi bioinformatica è assolutamente necessaria. Refertare un CMA è un lavoro complesso e lungo che richiede parecchia expertise da parte dell operatore e spesso la necessità di conoscere il fenotipo in dettaglio. 8

9 Diag. Prenat. CMA vs cariotipo (DP) DR CGH = 2 X DR Kar Tempi di risposta più rapidi Costi in rapida discesa Indicazioni: stesse del cariotipo indipendenti dall età materna. CMA Non vede traslocazioni bilanciate Vede isodisomie (Eterodisomie se genit.)

10 Ma.. Può identificare varianti il cui significato clinico è sconosciuto (dati non ancora sufficienti per una correlazione genotipo fenotipo) Necessita spesso dell analisi dei genitori Può occorrere il test di paternità (microsatelliti) Il criterio di patogenicità di una variante de novo non è assoluto ed ha meno forza rispetto alla diagnosi prenatale Le varianti possono avere una penetranza incompleta o un espressività variabile rischio di falsi positivi. ( Uccidere un feto sano)

11 Le problematiche CNVs non presenti nei db popolazione generale, non contenenti geni conosciuti come patogenetici VOUS. CNVs de novo ma non patogenetiche CNVs ereditati : penetranza incompleta (es: 7q11.23 dup, 1q21.1 del/dup, 15q13.3 deletion, 16p11.2 dup, 22q11.21del/dup..)

12 Predittività e prevalenza Valore predittivo positivo di un test (VPP) : prob che un soggetto positivo al test sia realmente affetto (proporzione Non bisogna di soggetti confondere positivi la probabilità che sono affetti) di risultare positivo Conoscere ad il un tasso test di qualora falsi positivi si sia e sani negativi ( che non dipende è dal sufficiente test), con ma la probabilità occorre sapere di essere anche la sani reale qualora prevalenza si sia della positivi malattia. test ( che dipende anche dalla prevalenza) Se la malattia è rara, anche se il tasso di falsi positivi è ridotto, un risultato positivo al test ha alte probabilità di non essere significativo. E importante sapere se si è in un gruppo a rischio alto 12

13 E nella diagnosi prenatale? De novo è un criterio forte? Probabilità di non essere malati ( CNV de novo non causativa) se si ha una CNV de novo? 2% della pop. gen. ha una CNV de novo non causativa (> 100 Kb) (falsi positivi) Possiamo approx. che negli individui con DI e ACM, il 20% ha una CNV de novo causativa ( veri positivi) 13

14 In diagnosi postnatale Supponiamo falsi negativi = 0 Su individui con DI/ACM ci sono 2000 veri positivi ( in cui la CNV de novo è causativa) e 200 falsi positivi (CNV de novo non causativa) Prob di essere affetto (CNV de novo causativa) = veri pos./ (veri pos. + falsi pos.) = 2000 /( ) oltre il 90% 14

15 In diagnosi prenatale Su feti (senza alcuna indicazione) ce ne saranno circa 2/100 (200) con DI/ACM e 9800 normali. Ci saranno dunque 40 (20% di 200) con CNV de novo causative e 200 con CNV de novo non causative. Prob che una CNV de novo sia causativa = 40/240 meno del 17% Il criterio de novo perde molta forza 15

16 A de novo deletion of 3.5 Mb The deletion was not present in the Database of Genomic Variants what about if detected in prenatal diagnosis???? Courtesy of Prof. O. Zuffardi

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18 Array-targeted a bassa risoluzione : <<VOUS ma può non identificare zone prive di sonde o inferiori al limite di risoluzione 18

19 Evoluzione nella velocità del sequenziamento 19

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21 Next Generation Sequencing Si basa sul principio del sequenziamento clonale Frammentazione random del DNA da sequenziare Ligazione dei frammenti con linkers specifici Amplificazione clonale dei singoli frammenti Sequenza parallela di milioni di amplificati clonali tramite sintesi con terminatori, pyrosequencing, variazioni del ph Un singolo strumento può generare diverse Gbasi / giorno Sequenziamento mediante sintesi (SBS) Sequenziamento mediante ligazione (SBL) SOLID terminatori SOLEXA Piroseq. 454 Var. ph Ion Torrent 21

22 NGS Whole genome sequence (WGS) ~ 3x10 9 nt Whole exome sequence (WES) ~ 3x10 7 nt Targeted sequence (pannelli di geni) variabile 22

23 Varianti identificate tramite NGS Whole genome NGS : 3-4 milioni di varianti Exome NGS (~ 1% del genoma, ~85% delle mutazioni conosciute cade nella porzione codante ): vars Filtri: Affidabilità tecnica delle varianti Varianti sinonime Modalità di trasmissione Esclusione di varianti conosciute tramite database Possono rimanere centinaia di var ( non sinonime o di splicing). Si devono applicare ulteriori strategie caso- specifiche. Pipeline bioinformatica necessaria 23

24 NGS 24

25 NGS nella routine diagnostica Il sequenziamento di Sanger è stato il gold standard nella diagnostica molecolare, soprattutto per le malattie genetiche per le quali sono prevalentemente responsabili mutazioni rare o private. Oggi tuttavia esso non rappresenta più un metodo soddisfacente nella pratica diagnostica, soprattutto in presenza di malattie geneticamente eterogenee o dovute a mutazioni che interessano geni di grosse dimensioni e che non si raggruppano in particolari domini. 25

26 Malattie con test facili Malattia Gene Mutazione X Fragile FMR1 Repeat FRAXE FMR2 Repeat Atassia di Friedreich FRDA Repeat Haw River DRPLA Repeat Huntington tipo 1 HD Repeat Kennedy AR Repeat Distrofia miotonica DMPK / ZNF9 Repeat Atassia spinocerebellare SCA1,2, 3, 6, 7, 8,10, 12,17 Repeat Sordità GJB2 1 mutazione comune Charcot-Marie-Tooth Tipo 1A PMP22 1 mutazione comune Neuropatia ereditaria (HNPP) PMP22 1 mutazione comune Atrofia muscolare spinale SMN1 1 mutazione comune Emocromatosi di tipo 1 HFE 2 mutazioni comuni Anemia falciforme HBB 1 mutazione comune Fibrosi cistica CFTR Mutazioni comuni 26

27 Test difficili Malattia Gene Mutazioni Cancro al seno BRCA1 Private BRCA2 Private Cancro al Colon MLH1 Private MSH2 Private MSH6 Private 27

28 Malattie Disturbi della glicosilazione Eterogeneità genetica Numero di geni (approx.) 28 Disturbi del neurosviluppo 150 Paraparesi spastiche 30 Epilessia 130 Distrofie muscolari 45 Sordità 70 Rasopatie 10 Microcefalia 11 28

29 Mutazioni de novo: lezioni da NGS Dati NGS (genoma): tasso di mut. per nucleot x 10-8 Circa 74 mutazioni de novo su genoma per generazione Dati NGS (esoma): tasso di mut. per nucleot. 1.5 x 10-8 Circa 1 mutazione de novo su esoma per generazione Il tasso di mutazione aumenta con l età paterna 29

30 Flowchart Sanger: AD Sospetto diagnostico caso sporadico Screening di un gene Spesso vous Variante missense An. filogenetica De novo? Screening popolazione Gene di 9000 pb codificanti: p(de novo casuale) = 1 x (9000/30*10 6 ) = 3/10.000

31 Targeted NGS Parallelamente alla WES sono stati sviluppati dei metodi che permettono di sequenziare determinate regioni genomiche di nostro interesse. E particolarmente usata nell analisi di geni lunghi, nell approccio diagnostico delle malattie geneticamente eterogenee, in farmacogenetica. L arricchimento delle sequenze d interesse viene attuato tramite diversi protocolli ( ibridazione selettiva, circolarizzazione molecolare, PCR). Il costo e la difficoltà d interpretazione sono più bassi e il coverage più alto rispetto alla NGS whole exome. 31

32 NGS targeted La NGS targeted su geni prescelti dà la possibilità di sequenziare contemporaneamente un pannello di geni responsabili di una o di diverse malattie con fenotipo difficilmente distinguibile. Ogni test include usualmente da 10 a centinaia di geni. Questo approccio permette di aumentare molto la sensibilità clinica del test, precedentemente ostacolata dall alto numero di geni potenzialmente responsabili. La profondità di lettura è più alta 32

33 Nn Nat. Rev. Genet Apr;14(4):

34 Sanger vs targeted NGS Target cds Pochi campioni Molti campioni <1.000 bp Sanger Sanger < bp Sanger NGS >10000 bp NGS NGS 34

35 NGS nella routine clinica: conclusioni I SS è ancora lo standard nella routine clinica, le sue caratteristiche impongono dei limiti nella velocità e nella quantità di target da sequenziare. L NGS targeted permette: Alta processività (quantità di DNA sequenziato/tempo) Alta profondità di lettura (<< errori di lettura, mosaic.) Possibilità di costruire pannelli di geni malattia specifici Possibilità di sequenziare un alto numero di campioni contemporaneamente Costi oramai competitivi con SS Alcuni centri attrezzati direttamente exome seq e successiva analisi geni candidati 35

36 NGS nella routine clinica: conclusioni II La tecnologia NGS e il costante abbattimento dei suoi costi sta rivoluzionando la genomica. La sua applicazione nel campo della ricerca sta portando ad una rapida identificazione di geni mendeliani e di fattori di rischi ad alta penetranza L uso della NGS whole genome / exome nella diagnosi si scontra contro un insufficiente comprensione delle implicazioni cliniche dell enorme mole di dati genetici. In attesa di colmare questo gap culturale, l implementazione di test mirati su pannelli di geni specifici, volti ad ottenere risposte diagnostiche e/o prognostiche chiare, possono (e devono) già oggi essere messi a disposizione del SSN. 36

37 NIPT: non invasive prenatal testing Misura la quantità di DNA fetale libero (cfdna) presente nel sangue della gravida. Il cfdna comprende ~2-20% del DNA libero circolante. Aumenta con l età gestazionale. La NIPT determina se c è una quantità alterata di cfdna di particolari sequenze dei cromosomi 13, 18, 21 rispetto a quella attesa. Non è invasiva ( prelievo del sangue dalla gravida) Si può già effettuare dalla 9 settimana di gravidanza 37

38 Two Sources of Fetal DNA in Maternal Blood Fetal cells 1 in a billion of total cell population Require isolation via mechanical and/or biochemical means Cell-free DNA (cfdna) Maternal blood contains both maternal and fetal cfdna 2 20% of total cfdna is fetal.

39 Fetal Cell-free DNA in Maternal Blood A Reliable Analyte During Pregnancy Released through apoptosis Fetal cfdna likely arises from cytotrophoblastic cells of placenta Released into bloodstream as small DNA fragments ( bp) Reliably detected after 7+ weeks gestation Undetectable within hours postpartum.

40 DNA Sequencing using cell free DNA Fetal DNA fragments in maternal blood. Cell free DNA fragments are then sequenced. Compare the individual sequenced chromosomes against a reference for analysis..

41 Detection of Fetal Aneuploidy MPS Enables Precise Molecular Counting Fetal cfdna (20%) Maternal cfdna NOT TO SCALE 10% more Chr21 cfdna in T21 Counting VS Chromosomes: Trisomy Verinata. Content is proprietary and confidential.

42 Accuratezza del calcolo cfdna fetale cfdna Materno Cromosoma reference Cromosoma trisomico Frazione fetale ratio attesa per la trisomia 4% % % %

43 Evidenze per la NIPT Aneuploidie Sensibilità FPR Sindrome di Down % ~0.1% Trisomy % ~0.1% Trisomy % ~0.1% Benn et al, Ultras Obstet Gynceol 2013, 42: 15-33

44 Il PPV scende molto quando il test si applica su gravidanze a rischio basso N Engl J Med 2013: 369;6 44

45 NIPT Indicazioni Età materna avanzata Aumento del rischio da test biochimici controindicazioni Anomalie fetali Gravidanza multipla Ansia da test invasivi Anomalie note non rilevabili con la NIPT

46 NIPT : conclusioni La NIPT è una tecnologia molto promettente ed ha il potenziale di offrire un test precoce e non invasivo. La NIPT non dovrebbe essere in questo momento il primo test da effettuare per lo screening per le trisomie 21, 13, 18 dato che la sua validità ed utilità clinica non sono ancora state dimostrate per le gravidanze non a particolare rischio. Attualmente la NIPT è un test di screening visto che deve essere sempre confermato da un test invasivo. Ulteriori studi sono necessari affichè la NIPT diventi un test diagnostico. 46

47 47

48 Grazie per l attenzione 48

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