6 ANNO LAUREA MAGISTRALE IN MEDICINA E CHIRURGIA CORSO DI GENETICA MEDICA Prof.ssa A. Ferlini- M.Neri

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1 6 ANNO LAUREA MAGISTRALE IN MEDICINA E CHIRURGIA CORSO DI GENETICA MEDICA Prof.ssa A. Ferlini- M.Neri CALENDARIO LEZIONI 8 OTTOBRE Marcella Neri CONSULENZA GENETICA E ANALISI DEL PEDIGREE 15 OTTOBRE Prof.ssa Alessandra Ferlini BIOETICA IN GENETICA MEDICA 22 OTTOBRE Marcella Neri ANALISI CITOGENETICA 18 NOVEMBRE Neri STRATEGIE DELLA DIAGNOSI MOLECOLARE 25 NOVEMBRE Marcella Neri ONCOGENETICA E NEOPLASIA EREDITARIE 2 DICEMBRE Prof.ssa Alessandra Ferlini TERAPIE IN GENETICA MEDICA 9 DICEMBRE Marcella Neri BIOINFORMATICA E DATABASE GENETICI 15 DICEMEMBRE Prof.ssa Alessandra Ferlini LE MALATTIE RARE GENETICHE

2 STRATEGIE DELLA DIAGNOSI MOLECOLARE 18 NOVEMBRE 2014 MARCELLA NERI

3 MOLECULAR DIAGNOSIS OF HUMAN DISORDERS IS THE DETECTION OF THE VARIOUS PATHOGENIC MUTATIONS IN DNA AND /OR RNA SAMPLES IN ORDER TO FACILITATE DIAGNOSIS, SUB-CLASSIFICATION, PROGNOSIS, AND MONITORING RESPONSE TO THERAPY THE AIMS OF MOLECULAR DIAGNOSIS ARE - CONFIRM THE CLINICAL DIAGNOSIS - PREDICT THE CLINICAL COURSE OF THE DISEASE ( GENOTYPE/ PHENOTYPE RELATIONS) - IDENTIFY OTHER FAMILY MEMBER AT RISK - PERFORM PRENATAL DIAGNOSIS - PLAN A SPECIFIC TERAPHY IF AVAILABLE

4 MOLECULAR ANALYSIS ON.

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6 1% EXOME Protein-coding regions constitute 1% of the human genome or 30 megabases (Mb), split across 165,637 exons 27.9Mb of coding sequence defined by CCDS (the NCBI Consensus Coding Sequence database) CcdsBrowse.cgi

7 ESTRAZIONE DNA da sangue La figura illustra gli step di estrazione con fenolo-cloroformio (A), la successiva precipitazione con etanolo assoluto (B), il lavaggio con etanolo (C) del pellet ottenuto dopo centrifugazione, l essiccamento all aria (D) e la risospensione in acqua o TE (E)

8 History of Molecular Diagnos3cs The Molecular Biology Timeline 1865 Gregor Mendel, Law of Heredity 1866 Johann Miescher, Purification of DNA Sickle Cell Anemia Mutation Watson and Crick, Structure of DNA 1970 Recombinant DNA Technology 1977 DNA sequencing 1985 In Vitro Amplification of DNA (PCR) 2001 The Human Genome Project

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10 PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Pipe?e Tips Thermal cycler Buffer DNTP MgCl2 Taq Polimerase Eppendorf

11 Step 1. Denaturation Raise temperature to 94 o C to separate the duplex form of DNA into single strands

12 Design primers To perform PCR, a 10-20bp sequence on either side of the sequence to be amplified must be known because DNA pol requires a primer to synthesize a new strand of DNA

13 Anneal primers at o C Step 2. Annealing

14 Step 3.Extension Extend primers: raise temp to 72 o C, allowing Taq pol to at each priming site and extend a new DNA strand

15 Repeat Repeat the Denature, Anneal, Extension steps at their respective temperatures

16 DNA ANALYSIS PCR-BASED TECHNIQUES PCR AND DIRECT SEQUENCING PCR REPEATED REGIONS (MICROSATELLITES, TRIPLETS) REAL TIME PCR MLPA POINT MUTATIONS/ SMALL DEL-DUP VNTR/ DINAMIC MUTATIONS DELETIONS/ DUPLICATIONS

17 mutazioni I daz di sequenziamento totale del genoma provano che almeno 10-8 sosztuzioni geniche per base si verificano nella prole de novo, cioè senza essere ereditate dai genitori meno dell 1% cadono negli esoni codificanz dei geni mutazioni silenz, quando l aminoacido non cambia mutazioni missenso quando un aminoacido è sosztuito da un altro aminoacido mutazioni nonsenso quando un aminoacido è sosztuito da un codone prematuro di terminazione mutazioni nonstop quando al contrario un codone di terminazione è sosztuito da un codone di un aminoacido

18 classificazione delle mutazioni 1. sosztuzioni 2. piccole inserzioni, delezioni o inserzioni + delezioni contemporaneamente (indels) 3. riarrangiamenz genomici a due (delezioni, duplicazioni) o più punz di (traslocazioni, inversioni ecc.) 4. copy number variazons (CNV) a queste classi appartengono in modo indisznguibile tanto le variazioni innocue quanto le mutazioni causazve di malaha

19 PCR AND DIRECT SEQUENCING POINT MUTATIONS/ SMALL DEL-DUP SANGER SEQUENCING ( 1st generation)

20 Wild-type Mutato

21 ins TTAA het

22 DNA ANALYSIS PCR-BASED TECHNIQUES PCR AND DIRECT SEQUENCING PCR REPEATED REGIONS REAL TIME PCR MLPA POINT MUTATIONS STR-VNTR/ DINAMIC MUTATIONS DELETIONS/ DUPLICATIONS

23 VNTR (variable number tandem repeats) STR (short tandem repeats) Location in a genome where a short nucleotide is organized as a tandem repeat These can be found on many chromosomes and often show variations in length Each variant acts as an inherited allele allowing used for identification Useful in genetics, biology research, forensics and DNA fingerprinting - Occurs when a pattern of TWO or more nucleotides are repeated and the repeated sequences are adjacent to each other. Pattern can range in length from 2 to 10 bp Typically in non-coding intron region Count how many repeats of a specific STR at a given locus can create unique genetic profile Currently over 10,000 published STR sequences in human genome Prevalent method for determining genetic profiles in forensic cases.

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26 REQUISITI per l ANALISI DI LINKAGE DI CARATTERI MENDELIANI MARCATORI GENETICI Polimorfici -> presenza di 2 o + alleli alternativi Allele più raro con frequenza di almeno 1% nella popolaz. Facilmente tipizzabili e stabili di generazione in generazione Posizione nota nel genoma Gli individui delle famiglie vengono tipizzati per un set di marcatori polimorfici distribuiti su tutto il genoma o in particolari regioni candidate Per tutti i cromosomi sono state create mappe genetiche di marcatori polimorfici 26

27 Mental Retardation Seizu res Osteopor osis

28 Mutazioni dinamiche

29 Malahe da ripetute Disease Gene Locus/Protein Repeat LocaZon Fragile X syndrome Fragile XE syndrome Friedreich ataxia Myotonic dystrophy 1 Myotonic dystrophy 2 Spinobulbar muscular atrophy HunZngton disease Dentatorubralpallidoluysian atrophy SCA type 1 SCA type 2 SCA type 3 (Machado- Joseph disease) SCA type 6 SCA type 7 SCA type 8 SCA type 12 Xq27.3/FMR- 1 protein Xq28/FMR- 2 protein 9q13-9q21.1/frataxin 19q13/myotonic dystrophy protein kinase 3q21 Xq13- Xq21/androgen receptor 4p16.3/hunZngton 12p13.31/atrophin- 1 6p23/ataxin- 1 12q24/ataxin- 2 14q32.1/ataxin- 3 19p13/α- 1A (voltage- ependent calcium channel subunit) 3p12-3p13/ataxin- 7 13q12/none idenzfied 5q31-5q33 CGG GCC GAA CTG CCTG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CTG CAG Noncoding Noncoding Noncoding Noncoding Noncoding Coding Coding Coding Coding Coding Coding Coding Coding? Noncoding

30 Malahe da ripetute non codificanz

31 Circa il 2% della popolazione ha un IQ<70 (ritardo mentale) il 15-20% di tuh I ritardi mentali sono a geni del cromosoma X Il ritardo mentale legato al cromosoma X (XLMR) è genezcamente eterogeneo con 202 loci responsabili di forme che si sovrappongono clinicamente 46 geni sono staz a oggi idenzficaz il locus che contribuisce alla frazione maggiore causa la sindrome di MarZn- Bell, oggi nota come sindrome dell X fragile

32 X fragile ritardo mentale: IQ tra 20 e 70 deficit di memoria a breve termine di informazioni complesse ritardo nel linguaggio abilità visuo- spaziali ipersensibilità agli szmoli iperahvità con deficit di comportamento auzszco Macrocefalia con fronte, mento e orecchie sporgenz Macroorchidismo (<30ml) dopo la pubertà Anomalie connehvali: prolasso della mitrale, lassità arzcolare, piede Disfunzioni ipotalamiche?

33 Nel 1969 Lubs osservò una costrizione (marker X) sul braccio lungo del cromosoma X in maschi affeh e tre carriers obbligate della stessa famiglia

34 Il sito fragile a Xq27.3 o costrizione dei cromosomi in metafase che insorge quando le cellule sono esposte ad una perturbazione della replicazione del DNA siz fragili sono su tuh i cromosomi e prendono il nome della banda cromosomica, es fra(x)(q27.3) la nomenclatura HUGO chiama questo sito FRAXA, cioè il primo sito fragile idenzficato sul cromosoma X

35 Segregazione, paradosso di Sherman Il 20% dei maschi che portano l allele mutato sono normali (NTM) I Il 30% delle carrier presenta ritardo mentale perché è 1 perché non è II III 1 IV

36 Il gene FMR

37 EcoRI CpG island/5 UTR FMR1 gene Eag I probe EcoRI 2.4kb 2.8kb (CGG) ~ 6 to 50 (CGG) 59 to ~ 200 Normal alleles : Stable in the family and in the individual Unstable in the populazon (Polymorphism) PremutaZon : Unstable in the family Stable in the individual (CGG) > 250 MethylaZon Full mutazon : Unstable in the individual (somazc mutazons) Repress FMR1 transcripzon

38 Premutazioni e mutazioni Le premutazioni si espandono quando sono trasmesse dalla madre La donna con premutazioni ha un maggiore rischio di menopausa precoce POF (premature ovarian failure) Il più corto allele che in una sola generazione è diventato mutazione piena è di 59 Espansione stabile (CGG)9- AGG- (CGG)9- AGG- (CGG)9 Ha almeno 2 A che interrompono la serie di 9 triple4e Espansione instabile (CGG)9- (CGG)9- (CGG)9- (CGG)9 NON ha A che interrompono la serie

39 COSA FA FMR1? FMRP una RNA-binding protein selettiva associata con i poliribosomi ed espressa nei neuroni nelle spine dendritiche regola la traduzione degli mrna, funzione cruciale per la plasticità sinaptica e la maturazione neuronale interagisce con gli mrna e con il pathway dei mirna Nell X fragile le spine dendritiche sono immature e lunghe Cerebral Cortex, Vol. 10, No. 10, , October 2000

40 distrofia miotonica DM1 fenomeno miotonico, difficoltà al rilasciamento muscolare dopo una contrazione ipotonia al volto, non debolezza importante precoce alterazioni ritmo cardiaco disfunzione Zroidea trasmissione autosomica dominante (1/8000) forma congenita con grave ipotonia neonatale

41 distrofia miotonica DM1 Steinert è la più comune distrofia muscolare dell adulto è causata da un espansione CTG nel 3 UTR del gene DMPK (nell RNA CUG) a 19q13.3 presenta eredità autosomica dominante con anzcipazione sono state idenzficate RNA binding proteins che interagiscono con l espansione CUG

42 distrofia miotonica DM2 cromosoma 3p21 un espansione simile nell introne 1 di un repeat CCUG nel gene ZNF9 (zinc finger protein 9) causa la distrofia miotonica 2 la DM2 è anche distrofia miotonica prossimale

43 Malahe da ripetute di poliglutammina

44 Còrea di HunZngton da George HunZngton nel 1872, è anche còrea che in greco indica la danza alla base vi è una degenerazione programmata genezcamente dei neuroni dei gangli basali (nuclei caudato e pallido) e della corteccia prevalenza di 1/10,000 e presenta il fenomeno dell'anzcipazione si nel 97% dei casi come autosomico dominante associato al gene hunzngzna sul cromosoma 4p16.3 solo il 3% dei casi è dovuto a nuove mutazioni un'espansione dinamica della CAG che codifica per la glutammina

45 quante glutammine? fino a 28 = numero max di CAG per un non a rischio CAG la malaha si potrebbe presentare alla generazione successiva (premutazione) oltre 39 CAG il è considerato anche se la patologia non si è ancora manifestata il test è in grado di prevedere che la patologia si manifesterà in futuro l'esecuzione in soggeh sani solleva problemi di natura ezca

46 la Huntingtina con poliglutammina forma aggregati nei neuroni causandone la morte all'inizio sintomi psichiatrici quali depressione, irritabilità, difficoltà a prendere decisioni, poi presenta movimenti incontrollati simili a una danza e demenza pur con una grande variabilità individuale, la malattia avanza inesorabilmente fino alla morte tentativi terapeutici sono in corso con la cistamina che inibisce la transglutaminasi coinvolta nella formazione degli aggregati

47 DNA ANALYSIS PCR-BASED TECHNIQUES PCR AND DIRECT SEQUENCING PCR REPEATED REGIONS (MICROSATELLITES, TRIPLETS) POINT MUTATIONS VNTR/ DINAMIC MUTATIONS REAL TIME PCR MLPA DELETIONS/ DUPLICATIONS

48 REAL-TIME PCR Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"

49 Primer R Q Primer La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare

50

51 Sonde Taqman Le sonde di idrolisi o sonde Taqman sono costituite da oligonucleotidi marcati in 5' con un fluoroforo reporter (donatore) e in 3', o internamente, con un quencher (accettore); vengono disegnate in modo che si leghino ad una sequenza specifica del bersaglio compresa tra i primers forward e reverse. Le sonde intatte non emettono fluorescenza perché la vicinanza del quencher al reporter induce una soppressione della fluorescenza del reporter. Nella fase di estensione dei primers, la sonda Taqman, complementare alla sequenza dell'amplicone, si lega al prodotto PCR e, quando viene raggiunta dalla polimerasi, subisce l'idrolisi da parte dello stesso enzima (attività 5 3 esonucleolitica). A questo punto, il fluoroforo (dye), allontanato dal quencher, se eccitato, emette fluorescenza. No fluorescenza Emissione di fluorescenza

52 Nella Real-Time PCR, i primi cicli, in cui non è misurabile la variazione nel segnale della fluorescenza, definiscono un importante parametro: la linea base (baseline) della curva. Linea soglia Un aumento della fluorescenza oltre la linea base indica il rilevamento del prodotto di PCR in fase di accumulo. Linea di base Ct Un secondo parametro importante è la linea-soglia: tale linea, parallela alla linea di base, deve tagliare le curve dei campioni nella loro fase di crescita esponenziale. La curva di amplificazione di ogni campione taglia la linea-soglia in un punto, chiamato ciclosoglia (threshold cycle) definibile come il numero del ciclo (o frazione di questo numero) in cui la curva di amplificazione del campione in fase esponenziale taglia la linea-soglia. Il ciclo-soglia, al contrario di un valore misurato alla fine dell'amplificazione, è un indicatore fedele della quantità iniziale di DNA.

53 MLPA (multiple ligation probe amplification) DELETIONS/ DUPLICATIONS identification

54 HybridizaZon 1. The MLPA probemix is added to denatured genomic DNA 2. The two parts of each probe hybridise to adjacent target sequences

55 3. Probes are ligated by a thermostable ligase ligazon

56 PCR amplificazon 4. A universal primer pair is used to amplify all ligated probes The PCR product of each probe has a unique length ( bp)

57 separazon and quanzficazon by capillary electrophoresis Each peak is the amplificazon product of a specific probe. Samples are compared to a control sample. A difference in relazve peak height or peak area indicates a copy number change of the probe target sequence

58 deteczon of Chr X copy number X Male Female Triple X 283 bp 346 bp

59 OMIC analysis next generation sequencing CGH array

60 SANGER SEQUENCING 30 years NEXT GENERATION SEQUENCING Frederick Sanger 1975 DNA sequencing 454 ROCHE 2005 SOLID APPLIED Modello del DNA human genome project SOLEXA/ILLUMINA 2006 ION TORRENT 2010 Watson & Crick Francis Collins Craig Venter

61 DIFFERENCES BETWEEN NGS AND CONVENTIONAL SANGER SEQUENCING Sanger sequencing of candidate genes is directed to a specific target. NGS as such is based on sequencing clonally amplified single molecules of DNA. Sanger sequencing generates long reads, meaning that one reaction deciphers bases allowing easy sequence assembly. In principle, one sequence suffices to identify homozygous and heterozygous sequence variants because every reaction contains and determines both possible alleles. Sanger sequencing always follows the same technical principle; NGS uses a number of different technical approaches. NGS needs between 10 and 50 reads of the same base to reliably identify heterozygous sequence variants, because every read shows only one of the possible two alleles in a stochastic distribution (coverage). The main advantage of NGS is the massive amount of generated sequence data : between 400 and 3000 megabases can be generated in one run of the instrument.

62 WORKFLOW del SEQUENZIAMENTO Library preparation Clonal amplification Cyclic array sequencing 1 Library preparation Emulsion PCR 2 Clonal amplification Solid-phase amplificatio n 3 Cyclic array sequencing pyrosequencing Sequencing by ligation semiconducto r sequencing Sequencing by reversible termination 454 SOLID ION TORRENT ILLUMINA

63 5. Bionforma3cs analysis IMAGE ACQUISITION QUALITY CONTROL DATA FILTERING REFERENCE SEQUENCE ALIGNMENT (BWA, SAMtool, SOAP) VARIANT CALLING (SAMtool, GATK, SOAP, Annovar) ANNOTATION (GATK, Annovar) TAQ COUNTING DATA REPORTING

64 6. Biological interpreta3on and iden3fica3on of causal muta3on WHY IS AN IMPORTANT STEP Number of variants per sequenced exome: Filtering for: quality criteria non coding variants synonymous variant Marian et al Potential disease causing variants: 5000 Filtering for: Known polymorphic variants Private, non-synonymous, splicesite variants Glissen et al. 2012

65 NEXT GENERATION METHODS FOR AN EXHAUSTIVE STUDY OF GENETIC DISEASES WHOLE EXOME SEQUENCING TO IDENTIFY NOVEL CAUSATIVE GENES CLINICAL EXOME INTERROGATING KNOWN GENES ON A WHOLE EXOME SEQUENCING OUTPUT TARGETED RESEQUENCING FOR THE DETECTION OF VARIANTS IN WELL-KNOWN DISEASE GENES WHOLE GENOME SEQUENCING (3 BILLIONS OF BASES SEQUENCED) TARGETED RNA SEQUENCING FOR THE DETECTION AND CHARACTERIZATION OF MUTATIONAL EFFECTS ON MRNA EXPRESSION AND ON ITS SPLICING

66

67 Comparative genomic hybridization (CGH) as originally configured is a molecular technique based on DNA hybridisation that allows detection of DNA sequence copy number variations (CNVs) and genome imbalance with high throughput potential (244K probes, covering intervals of 12 Kb-whole genome)

68 Cy5 Cy3

69 RNA PHENOTYPE (RIBOTYPE) THE VAST MAJORITY OF THE DNA MUTATIONS DOES HAVE EFFECT ON THE mrna MOLECULES

70 MOLECULAR ANALYSIS ON.

71 GENE STRUCTURE

72 PROCESSING THE GENETIC CODE After making a pre-mrna, the introns are removed and the exons are joined together to make a mature message (mrna), which is then read in 3 letter words (codons). iiiiiiiithe iiiiiiiibad AND iiiiiiiold DiiiiiOG ATETiiiiiiiiiiiHE FATiiiiii CAT ENDiiiii THE BAD AND OLD DOG ATE THE FAT CAT END

73 WHEN IS INDICATED TO EXPL0RE THE RNA CONFIGURATION? TISSUE-SPECIFIC PATHOLOGY SPLICING PATHOLOGY HETEROGENEOUS MUTATIONS IN LARGE GENES, UBIQUITOUSLY EXPRESSED PREREQUISITE PATIENTS TISSUE/CELLS

74

75 RNA ANALYSIS: METHODS RT-PCR RACE-PCR Real-time PCR NORTHERN BLOTTING MICROARRAYS

76 RT-PCR Extraction of total RNA from tissues Reverse transcription from RNA to cdna (complementary DNA) PCR analysis on the artificially synthesized cdna

77 mrna 5 AAAAA 3 Primer 1 3 TTTTT 5 mrna cdna cdna 3 Primer reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase) 5 AAAAA 3 TTTTT 5 3 Remove RNA (RNase A) Add PCR primers 3 TTTTT 5 TTTTT 5 Primer 3 Add Taq polymerase. Run PCR

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