Next Generation Sequencing nelle malattie non emopatiche

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1 Next Generation Sequencing nelle malattie non emopatiche Vilma Mantovani 1,2 & Tommaso Pipucci 2 1 Centro Ricerca Biomedica Applicata - CRBA 2 U.O. Genetica Medica Bologna, 11 maggio 2012

2 Gene discovery nelle malattie Mendeliane >7.000 malattie Mendeliane stimate circa con causa genetica identificata Analisi di linkage + positional cloning Homozigosity mapping Next Generation Sequencing Whole genome sequencing Exome sequencing

3 Exome sequencing

4 Causal genes identified by exome sequencing Bamshad, Nat Rev Genet 2011

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7 10 trios, mutazioni de-novo in 9 geni, 6 delle quali probabili causative 20 trios, 21 de novo point mutations, nuovi geni candidato 14 trios, 15 de novo point mutations in 8 probandi, nuovi geni candidato

8 Exome sequencing e tratti complessi GWAS Assunto: Varianti rare che influenzano un tratto co-localizzano con varianti comuni che influenzano il rischio Exome sequencing cattura varianti con MAF<0,1 2 approcci Family-based phenotype (more distally related individuals) Extreme phenotypes

9 Exome sequencing: pitfalls Incompleta cattura di tutti gli esoni Difficoltà con CNV, riarrangiamenti, famiglie geniche Capture e coverage variabili Mancanza regioni di regolazione Mancanza regioni non codificanti ultra-conservate Whole genome sequencing?

10 Whole genome sequencing: sfide > varianti! Identificare nuovi geni malattia nel background di varianti non patogeniche ed errori di sequenza Dare un senso alle varianti non codificanti

11 NGS nella diagnostica clinica: l exome sequencing Ha utilità provata in pazienti con: Presentazione atipica (IBD, Worthey Genet, Med 2011) Non attribuibili a categorie distinte (ritardo mentale, Vissers, Nat Genet 2010) Lista di geni candidati troppo lunga (Charcot-Marie-Tooth, Montenegro, Ann Neurol 2011)

12 Target-enrichment strategies for NGS Mamanova, Nat Methods 2010

13 Single target for many samples

14 NGS negli screening

15 NGS nella diagnostica: sfide Metodologia error rates di sequenziamento identificare le varianti strutturali procedure standard Interpretazione database esaustivo delle mutazioni rare integrazione tra mutazioni rare, varianti comuni e ambiente per tracciare i profili di rischio approccio a team (clinico, genetista, bioinformatico, bioetico) Etica consenso informato Incidental findings e loro comunicazione

16 SINGLE PATIENTS, SINGLE DISORDERS?

17 EXOME SEQUENCING vs. TRADITIONAL APPROACHES From Gilissen 2011

18 EXOME ANALYSIS PIPELINE

19 COMBINING EXOME AND HOMOZYGOSITY MAPPING OMIM: FA2H Cytogenetic location: 16q23.1 Chr 16: 16:74,746,852-74,808,728

20 COMBINING EXOME AND HOMOZYGOSITY MAPPING EFCAB6 p.l731f FA2H c.270+3a>t KIAA1407 c.1246_1246delg

21 MATtIA SYNDROME Microcephaly, Agenesis of the corpus callosum, Tetraparesis, AND epilepsy

22 LINKAGE ANALYSIS Xq21.33q24 DXS DXS ,5 Mb (95,16-119,82 Mb) 250 genes

23 CANDIDATE VARIANTS

24 OVERLAP WITH X-L MENTAL RETARDATION Isolato Sindromico XLMR Update del Greenwood Genetic Center, > 90 geni responsabili di ritardo mentale Diverse categorie funzionali implicate (enzimi, mediatori della trasduzione del segnale, proteine di legame, trasportatori e fattori di trascrizione) Processi cellulari implicati: trasporto delle vescicole sinaptiche (proteine Rab) formazione e maturazione dei dendriti (Rho GTPasi) trascrizione genica (pathway RAS/MAPK)

25 X-linked tetra amelia Sindrome estremamente rara caratterizzata da: totale assenza di tutti e quattro gli arti ampia serie di anomalie a livello del cranio, del sistema urogenitale, dei polmoni, dello scheletro e del sistema nervoso centrale Nell'uomo, la tetra-amelia è stata associata a mutazioni in WNT3 e WNT7a Il topo KO per Fgf10 è tetramelico

26 VARIANT DISCOVERY

27 TBX22 E CPX Mutazioni in TBX22 causano cleft palate con anchiloglossia (CPX OMIM#303400). Sono state descritte mutazioni di diverso tipo che causano CPX: missense, nonsense, indel e splice-site, la stragrande maggioranza delle quali si localizzano all'interno o nelle immediate vicinanze del dominio T-box. Tutte le mutazioni determinano un meccanismo di loss of function a livello proteico aboliscono o diminuiscono sensibilmente il legame della proteina al DNA inibiscono la sumoilazione L espressione di TBX22 nel palato è ben caratterizzata, in particolare Pauws e colleghi hanno generato un topo Tbx22 null che mostra cleft palate e anchiloglossia

28 UN POSSIBILE LINK TRA TBX22 E TETRA-AMELIA Espressione di Tbx22 nell embrione di pollo: somiti archi della faringe mascella occhi abbozzi degli arti inferiori e superiori E4, HH stadio 24 Coinvolgimento di geni Tbx nello sviluppo degli arti nel pollo mutazioni in TBX4 causano la small patella syndrome mutazioni in TBX5 causano la Holt-Oram syndrome

29 Grazie dell attenzione