SINDROMI MIELODISPLASTICHE

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1 SINDROMI MIELODISPLASTICHE MECCANISMI MOLECOLARI R. Piazza

2 MECCANISMI MOLECOLARI Bejar R et al. JCO 2011;29:

3 NEXT GENERATION SEQUENCING Flowcell

4 NEXT GENERATION SEQUENCING Library di DNA Genomic DNA Single-Read Paired-End ~100bp ~100bp

5 NEXT GENERATION SEQUENCING

6 HiSeq Lane/Flowcell 2 FLOWCELL 8 Lane/Flowcell 250 * 10^6 Cluster/Lane 250 * 10^6 Cluster/Lane 125bp 125bp 2 x 125bp/Cluster (Pair-end) Throughput = 2 * 8 * 250 * 10^6 * 2 * 125bp = bp!! = 1 Tb (Terabase)

7 MUTAZIONI SF3B1, DNMT3A, TET2, IDH1/2, ASXL1, EZH2, U2AF1, SRSF2, ZRSR2, PRPF8, JAK2, CBL, RUNX1, TP53, BCOR, BCORL1, RAS, SETBP1

8 SF3B1 22% TET2 20% EPIGENETICS ASXL1 15% RUNX1 10% DNMT3A 8% SRSF2 8% U2AF1 8% EZH2 5% IDH1/2 5% UTX 2%

9 MECCANISMI MOLECOLARI EPIGENETICA MUTAZIONI GENICHE: TET2 TET2 E, INSIEME AD SF3B1, IL GENE PIU FREQUENTEMENTE MUTATO IN MDS. MUTAZIONI DI TET2 SONO PRESENTI IN CIRCA IL 20% DEI PAZIENTI MDS OLTRE CHE IN PATOLOGIE MIELOPROLIFERATIVE, LEUCEMIA MIELOMONOCITICA CRONICA ED AML SECONDARIE. TET2 CODIFICA UNA DIOSSIGENASI IN GRADO DI CONVERTIRE LA 5- METILCITOSINA IN 5-IDROSSIMETILCITOSINA, ALTERANDO PERTANTO IL PATTERN EPIGENETICO.

10 MECCANISMI MOLECOLARI EPIGENETICA MUTAZIONI GENICHE: IDH1 E IDH2 IDH1 ED IDH2 SONO ENZIMI RESPONSABILI DELLA CONVERSIONE DELL ISOCITRATO IN ALFA- CHETOGLUTARATO. SONO LOCALIZZATI A LIVELLO DEL CITOPLASMA E DEL MITOCONDRIO, RISPETTIVAMENTE. LE MUTAZIONI IDENTIFICATE SONO TIPICAMENTE DI TIPO MISSENSE ED ETEROZIGOTI. LE MUTAZIONI DI IDH1 ED IDH2 SONO RESPONSABILI DI UN ALTERAZIONE DELL ATTIVITA ENZIMATICA DELLA CORRISPONDENTE PROTEINA CHE CAUSA UN NOTEVOLE INCREMENTO NEI LIVELLI INTRACELLULARI DI 2- IDROSSIGLUTARATO (2HG). 2HG A SUA VOLTA INIBISCE L ATTIVITA ENZIMATICA DI TET2, CAUSANDO, IN ULTIMA ANALISI, IPERMETILAZIONE DEL DNA GENOMICO.

11 MECCANISMI MOLECOLARI EPIGENETICA MUTAZIONI GENICHE: IDH1 E IDH2

12 MECCANISMI MOLECOLARI EPIGENETICA MUTAZIONI GENICHE: EZH2 ED ASXL1 EZH2 CODIFICA PER UN ISTONE METILTRASFERASI, SUBUNITA CATALITICA DEL POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX 2 (PRC2). EZH2 REPRIME L ESPRESSIONE GENICA TRAMITE TRIMETILAZIONE DELLA LISINA 27 DELL ISTONE 3 (H3K27me3). IN DIVERSI TIPI DI NEOPLASIE SONO STATI IDENTIFICATI SIA OVERESPRESSIONE CHE MUTAZIONI PUNTIFORMI INATTIVANTI/DELEZIONI, IL CHE SUGGERISCE COME, A SECONDA DEI GENI TARGET, EZH2 POSSA GIOCARE UN RUOLO SIA COME ONCOGENE CHE COME ONCOSOPPRESSORE. MUTAZIONI IN ASXL1 SONO STATE DESCRITTE IN CIRCA IL 10% DELLE MDS. ASXL1 FORNISCE LA SPECIFICITA DI RICONOSCIMENTO DEL SITO DI TARGET.

13 MECCANISMI MOLECOLARI EPIGENETICA MUTAZIONI GENICHE: DNMT3A FA PARTE DELLA FAMIGLIA DELLE DNA METILTRANSFERASI (DNMTs), CHE COMPRENDE DNMT 1, 3A E 3B. LE METILTRANSFERASI SONO ENZIMI RESPONSABILI DELLA METILAZIONE DEL DNA A LIVELLO DEI DOPPIETTI CpG daughter strand daughter strand

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15 SF3B1 22% TET2 20% ASXL1 15% RUNX1 10% EPIGENETICS SPLICING DNMT3A 8% SRSF2 8% U2AF1 8% EZH2 5% IDH1/2 5% UTX 2%

16 MECCANISMI MOLECOLARI RNA-SPLICING MUTAZIONI GENICHE: SF3B1 SF3B1 CODIFICA PER LA SUBUNITA 1 DEL COMPLESSO DI SPLICING 3b. TALE COMPLESSO, INSIEME AL 3a ED ALL RNA 12S, FORMA IL COMPLESSO RIBONUCLEOPROTEICO U2 (U2 snrnp). U2 LEGA L RNA NELLA REGIONE CHE PRECEDE L INTRON BRANCH SITE E CONTRIBUISCE AL CORRETTO SPLICING.

17 MUTAZIONI GENICHE: SF3B1 MUTAZIONI A CARICO DEL GENE SF3B1 SONO STATE IDENTIFICATE TRAMITE WHOLE- EXOME SEQUENCING. TALI MUTAZIONI SI VERIFICANO NEL 68-75% DELLE RARS E NELL 81% DELLE RARS- T MENTRE SONO RARE NELLE ALTRE MDS. I PAZIENTI AFFETTI DA RARS O RARS-T POSITIVI PER MUTAZIONI DI SF3B1 HANNO UNA PROGNOSI FAVOREVOLE. Papaemmanuil E. et al. N Engl J Med 2011; 365:

18 UN ANALISI STATISTICA DI EVENT-FREE SURVIVAL IN PAZIENTI MDS CARATTERIZZATI DA PRESENZA O ASSENZA DI UNA MUTAZIONE SOMATICA IN SF3B1 HA DIMOSTRATO COME LA PRESENZA DELLA MUTAZIONE RAPPRESENTI UN FATTORE PROGNOSTICO POSITIVO. CAVEAT: L ANALISI E STATA FATTA SULL INTERA POPOLAZIONE MDS, NON SU RARS.

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20 Epigenetic pathway: DNMT3A, TET2, IDH1/2, ASXL1, EZH2 RNA-splicing machinery: SF3B1, U2AF1, SRSF2, ZRSR2, PRPF8 Signaling pathway: JAK2, CBL Transcriptional factors and corepressors: RUNX1, TP53, BCOR/BCORL1 RAS family pathway Cohesin family Less frequent molecular mutations: SETBP1

21 MECCANISMI MOLECOLARI ANOMALIE CITOGENETICHE: DELEZIONE 5q- DELEZIONI 5q-: LE DELEZIONI DEL 5q SONO INVARIABILMENTE DI TIPO ETEROZIGOTE; NON SONO MAI STATE IDENTIFICATE ANOMALIE SOMATICHE NELL ALLELE NON DELETO, IL CHE SUGGERISCE COME LE ANOMALIE DEL 5q- SIANO DIPENDENTI DA UN MECCANISMO DI APLOINSUFFICIENZA. L ANALISI DEL LOCUS 5q- HA CONSENTITO DI IDENTIFICARE DUE REGIONI COMUNEMENTE DELETE: UNA DISTALE IN 5q33.1, ASSOCIATA AL FENOTIPO CLINICO DELLA SINDROME 5q- (BASSO RISCHIO DI PROGRESSIONE, BUONA PROGNOSI); UNA PROSSIMALE, LOCALIZZATA IN 5q31, FREQUENTE IN MDS SECONDARIE A CHEMIOTERAPIA E CARATTERIZZATA DA MAGGIORE AGGRESSIVITA E PEGGIORE PROGNOSI.

22 LA REGIONE PROSSIMALE, IN 5q31, CONTIENE DIVERSI GENI CANDIDATI, IN PARTICOLARE CTNNA1 (alfa-catenina). CTNNA1 E DOWNREGOLATA IN 5q-. IL SILENZIAMENTO EPIGENETICO DEL RIMANENTE ALLELE E ASSOCIATO A TRASFORMAZIONE IN FORMA ACUTA. LA REGIONE DISTALE CONTIENE RPS14, CHE CODIFICA PER LA SUBUNITA RIBOSOMIALE S40. MUTAZIONI CONGENITE IN GENI CODIFICANTI PROTEINE RIBOSOMIALI (RPS19) POSSONO CAUSARE L ANEMIA DI BLACKFAN- DIAMOND, IL CHE SUGGERISCE UN PROBABILE RUOLO DI QUESTO GENE NELLA SINDROME 5q-.

23 MECCANISMI MOLECOLARI

24 MECCANISMI MOLECOLARI - SIGNALING MUTAZIONI GENICHE: CBL CBL E UN UBIQUITINA LIGASI ASSOCIATA A TIROSIN-CHINASI (TK) IN GRADO DI REGOLARE NEGATIVAMENTE IL SIGNALING DI TALI ENZIMI INDUCENDONE LA DEGRADAZIONE. CBL RISULTA COMUNEMENTE MUTATO NELLA LEUCEMIA MIELOMONOCITICA CRONICA (15%) MA ANCHE IN MDS, SEBBENE PIU RARAMENTE (5%). LE MUTAZIONI DI CBL RISULTANO IN UN AUMENTO NEI LIVELLI DI TK. LE MUTAZIONI DI CBL SONO IN GENERE DOMINANTI NEGATIVE E SPESSO BIALLELICHE, IL CHE SUGGERISCE CHE CBL SIA UN ONCOSOPPRESSORE E CHE LA PERDITA COMPLETA DELLA SUA ATTIVITA DIA UN VANTAGGIO ALLE CELLULE TUMORALI.

25 MECCANISMI MOLECOLARI - TF MUTAZIONI GENICHE: RUNX1 MUTAZIONI PUNTIFORMI DI RUNX1 SONO STATE IDENTIFICATE IN NUMEROSE PATOLOGIE, TRA CUI MDS, LEUCEMIE MIELOIDI ACUTE, LEUCEMIA MIELOMONOCITICA CRONICA E, PIU RARAMENTE, IN PATOLOGIE MIELOPROLIFERATIVE. IN MDS MUTAZIONI DI RUNX1 SONO PRESENTI NEL 7-15% DEI PAZIENTI, CON MAGGIORE FREQUENZA IN MDS ORIGINATESI A SEGUITO DI PRECEDENTI TRATTAMENTE CON AGENTI CHEMIOTERAPICI. LE MUTAZIONI DI RUNX1 SONO DI TIPO LOSS-OF-FUNCTION E CONFERISCONO UNA PROGNOSI SEVERA. RUNX1 CONTIENTE UN DOMINIO PROSSIMALE RUNT, RESPONSABILE DEL BINDING AL DNA, ED UN DOMINIO DISTALE DI TRANSATTIVAZIONE, RESPONSABILE DELL INTERAZIONE PROTEINA-PROTEINA E QUINDI DEL RECLUTAMENTO DI COFATTORI.

26 MECCANISMI MOLECOLARI MUTAZIONI GENICHE: RAS MUTAZIONI NEI GENI DELLA FAMIGLIA RAS SONO FREQUENTI IN MDS. NRAS E MUTATO NEL 10-15% DEI PAZIENTI MDS E KRAS NELL 1-2%. TALI MUTAZIONI IN GENERE CONFERISCONO UNA PROGNOSI SEVERA, CON UN ELEVATO RISCHIO DI PROGRESSIONE AD AML.

27 MECCANISMI MOLECOLARI MUTAZIONI GENICHE: SETBP1 ANOMALIE SOMATICHE A CARICO DI SETBP1, UN GENE ASSOCIATO IN GERMLINE ALLA SINDROME DI SCHINZEL-GIEDION, SONO STATE INIZIALMENTE IDENTIFICATE NEL 24% DI CASI DI LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA ATIPICA E SUCCESSIVAMENTE ANCHE IN MDS (2.2%). LE MUTAZIONI DELL ONCOGENE SETBP1 PROTEGGONO LA PROTEINA DALLA DEGRADAZIONE MEDIATA DAL PROTEASOMA, CAUSANDONE ACCUMULO, ATTIVAZIONE DELL ASSE SETBP1- SET ED INIBIZIONE DELL ATTIVITA FOSFATASICA DELL ONCOSOPPRESSORE PP2A. LE MUTAZIONI DI SETBP1 SONO ASSOCIATE A PROGNOSI SEVERA.

28 CONCLUSIONI LE MDS SONO PER MOLTI ASPETTI PATOLOGIE ETEROGENEE ACCOMUNATE DA UN COMUNE DEFICIT NELLA CAPACITA DI DIFFERENZIAMENTO LA DISREGOLAZIONE DI PATHWAY EPIGENETICI GIOCA UN RUOLO CHIAVE NELL EZIOPATOGENESI DI QUESTE MALATTIE IL RUOLO DEI MECCANISMI DI SPLICING E PROBABILMENTE ALTRETTANTO IMPORTANTE MA ANCORA AGGI LARGAMENTE MISTERIOSO ALTRE LESIONI GENETICHE, QUALI LE MUTAZIONI DI RUNX1, KRAS O CBL, CONFERISCONO ALLA PATOLOGIA DISPLASTICA DI BASE UNA MAGGIORE AGGRESSIVITA CLINICA ED UN FENOTIPO LEUCEMICO