STRUTTURA PROTEINE_B

Transcript

1 1 STRUTTURA PROTEINE_B STRUTTURA PROTEINE_B...1 Proteine fibrose...2 Alfa-cheratina...2 -cheratina è un dimero composto da 2 eliche avvolte...2 Fibrina della seta...3 Collagene...5 LA STRUTTURA TERZIARIA...11 Proteine globulari:...11 STRUTTURA QUATERNARIA...14 COMPLESSI MULTIENZIMATICI...16 Triptofano-sintetasi...16 Enzimi bifunzionali...16 Il complesso della piruvato deidrogenasi di E.coli...17 DNA polimerasi VANTAGGI DELLE ATTIVITÀ MULTIPLE E DEI COMPLESSI MULTIENZIMATICI...18 CRISTALLOGRAFIA A RAGGI X...19 NMR...21 STABILITÀ DELLE PROTEINE forze elettrostatiche: legami-H forze idrofobiche ponti disolfuro...24 EVOLUZIONE STRUTTURALE...30 Introni ed esoni...30 Evoluzione divergente di famiglie di proteine...31 evoluzione convergente Convergenza o divergenza?...32 Evoluzione di proteine attraverso la fusione di frammenti genici...33 Il citocromo C è fra le proteine che più si sono conservate durante l'evoluzione...34 Struttura del citocromo C...35

2 2 Proteine fibrose Proteine molto allungate in cui la struttura secondaria è il motivo strutturale dominante. Si trovano nei tendini, nella pelle nelle ossa con funzione strutturale. Alfa-cheratina Nei mammiferi costituisce l 85% del contenuto delle cellule degli strati superiori dell epidermide. α-cheratina è un dimero composto da 2 eliche avvolte

3 Fibrina della seta 3

4 4

5 5 Collagene È un componente della matrice extracellulare del tessuto connettivo. È costituito da 3 catene polipeptidiche avvolte Possiede degli Aa insoliti

6 6 L Hyp è sintetizzata dalla prolil-idrossilasi e necessita di acido ascorbico. Sequenza ripetuta: Gly-X-Y

7 7

8 il collagene è organizzato in fibrille 8

9 9 Le fibrille di collagene sono legate covalentemente fra loro sia intramolecolarmente (all interno della stessa tripla elica) che intermolecolarmente.

10 10 La struttura terziaria Proteine globulari: Le proteine globulari contengono si ritrovano combinazione di elica e -strutture Mioglobina : composta di solo -eliche

11 11 Anidrasi carbonica : composta sia da -elica che da -strutture

12 12 In una proteina globulare: le catene laterali idrofobe si trovano prevalentemente all interno della proteina i residui carichi + o si trovano sulla superficie della proteina i residui polari possono trovarsi verso l interno della proteina (in questo caso inevitabilmente formano ponti-h con altri residui polari)

13 13 Struttura quaternaria aspartato transcarbamilasi

14 14 Complessi multienzimatici Alcuni enzimi in special modo quelli coinvolti in step sequenziali di una via biosintetica sono organizzati in aggregati fisici: 1.semplice associazione di 2 enzimi 2.complessi multienzimatici 3.grandi subunità come i ribosomi. Triptofano-sintetasi 2 2 complesso non covalente: indolo-3 glicero-fosfato Indolo + serina β2 α indolo + gliceraldeide-3 P triptofano l'intermedio (indolo) NON è rilasciato in soluzione. Enzimi bifunzionali Fosfofruttocinasi 2/fruttosio 2,6 bisfosfatasi (enzima tandem) 1 sola catena polipeptidica 2 attività enzimatiche diverse

15 15 Il complesso della piruvato deidrogenasi di E.coli Complesso multienzimatico molto grande (grande quanto un ribosoma!) La piruvato deidrogenasi è composta di 3 catene polipeptidiche: 1.E1: piruvato decarbossilasi 2.E2: lipoato acetil-transferasi 3.E3 lipoamide deidrogenasi il complesso è costituito da un core di 24 molecole del complesso E2. DNA polimerasi È composta da una una singola catena polipeptidica e da 3 siti attivi distinti: 1.DNA-polimerasi 2.esonucleasi 3' 5' 3.esonucleasi 5' 3'

16 16 Vantaggi delle attività multiple e dei complessi multienzimatici 1.aumento della capacità catalitica: diminuzione del tempo di diffusione di un intermedio da un enzima ad un altro 2.incanalamento del substrato: direzionamento del substrato verso uno specifico enzima piuttosto che permettere la competizione con altri enzimi in soluzione 3.sequestro degli intermedi reattivi: protezione di intermedi chimicamente instabili dal solvente acquoso 4.servicing: una subunità passa il substrato ad un'altra subunità (es. ACP nella acido grasso sintasi dei mammiferi) 5. regolazione coordinata: 6. espressione coordinata:

17 17 Cristallografia a raggi X Cristallizzazione di una proteina difficoltà Microscopio ottico: luce ( Å) su un oggetto la luce viene riflessa e rifratta e viene ricombinata da una serie di lenti che danno un'immagine allargata dell'oggetto. La risoluzione massima è ~ = alla λ della luce incidente. Per poter vedere molecole occorre una λ <= 1 Å (raggi X) Un cristallo di una proteina viene sottoposto ad un fascio di raggi X monocromatico si ottiene una diffrazione (le macchie scure della lastra) corrispondente alla densità elettronica del cristallo.

18 18 Non ci sono lenti per i raggi X che ricostruiscano l'immagine ricostruzione al computer (trasformazione di Fourier) per ottenere un modello di struttura compatibile con la mappa di densità elettronica. La struttura di una proteina cristallizzata è uguale a quella in soluzione???

19 19 NMR Studio della struttura delle proteine in soluzione!! Questo tipo di tecnica può vedere la dinamica, i movimenti delle proteine (non sono statiche, cristallizzate) Alcuni nuclei (1H; 13 C; 15 N etc) possiedono un tipo di spin nucleare che dà origine ad un segnale NMR. Lo spin nucleare genera un momento magnetico (questi atomi si comportano come magneti). Quando questoi atomi sono posti in un forte campo magnetico statico si allineano nel campo in 2 possibili orientamenti: 1) parallelo (bassa energia) 2) antiparallelo (alta energia) viene quindi applicata una radiazione con λ = onde radio i nuclei passano 1 H ad una energia più elevata (risonanza) assorbendo energia si ottiene uno spettro di assorbimento.

20 20 La differenza di frequenza di risonanza fra i protoni (che, teoricamente dovrebbe essere uguale) è dovuta all'ambiente in cui si trova ciascun protone che scherma + o il campo magnetico esterno. Una proteina contiene molte migliaia di protoni, quindi da uno spettro monodimensionale è impossibile ricostruire la struttura della proteina NMR bidimensionale!!

21 21 La tecnica NMR consente di vedere la dinamica della proteina

22 22 STABILITÀ DELLE PROTEINE Le proteine sono entità che sono solo relativamente stabili in condizioni fisiologiche. L energia libera per denaturarle è di appena 0.4 kj/mol per ogni Aa che compone la catena polipeptidica. Per una proteina di 100 Aa = 40 kj/mol L energia di un singolo legame-h è 20 kj/mol La struttura di una proteina è il risultato di un delicato equilibrio fra forze contrapposte 1.forze elettrostatiche: 2.legami-H 3.forze idrofobiche 4.ponti disolfuro

23 23 Forze elettrostatiche le proteine sono molecole che possiedono molte cariche + e sulla superficie. Energia di associazione fra 2 cariche (q1; q2) separate da una distanza r (D = cost dielettrica del mezzo=1 nel vuoto ed aumenta con la polarità del mezzo: acqua D=80): kq1 q 2 U= Dr 1) interazioni ioniche fra 2 residui con carica opposta (ponte salino; coppia ionica) di solito in ambiente acquoso le cariche sono solvatate (e quindi schermate) quindi questo tipo di interazione porta un piccolissimo contributo alla stabilità della proteina.

24 24 2)interazioni dipolo-dipolo (forze di van der Waals) questo tipo di interazioni elettrostatiche sono di per sè molto deboli (~4 kj/mol; leg covalente 400 kj/mol) ma ciononostante influenzano in modo significativo il foldind delle proteine perchè: 1)sono molto numerose 2)nel core della proteine c'è una costante dielettrica bassa (ambiente anidro) aumento interazioni elettrostatiche.

25 25 3)legami-H legame elettrostatico direzionale relativamente debole (12-29 kj/mol) i legami-h interni portano un grande contributo al mantenimento odella corretta conformazione configurazioni beta) della proteina (alfa-eliche

26 26 4)attrazioni idrofobiche forze idrofobiche: una sostanza idrofoba tende a minimizzare la superficie di contatto con il solvente polare (acqua) le molecole di acqua tendono a disporsi con regolatità intorno alla superficie idrofoba aumento di ordine = diminuzione di entropia disordine) (misura del situazione energicamente sfavorevole Il maggior contributo alla stabilità delle proteine è dato dalle INTERAZIONI IDROFOBICHE. (gli Aa idrofobici stanno all'interno della proteina ovvero in un ambiente anidro).

27 27 Profilo di idrofobicità di una proteina 5)ponti disolfuro sono presenti nelle proteine extracellulari. Nel citoplasma c'è un potenziale di riduzione piuttosto elevato (le cisteine si trovano allo stato ridotto: -SH)

28 28 EVOLUZIONE STRUTTURALE 4000 proteine diverse in E.coli, 6000 proteine nel lievito molte di più negli organismi superiori in che modo si è generata questa diversità?? Introni ed esoni i geni degli eucarioti sono discontinui. La variabilità dei prodotti genici può derivare da splicing alternativo. Molti isoenzimi anticorpi

29 29 Evoluzione divergente di famiglie di proteine Le serino-proteasi sono una famiglia di enzimi che hanno una struttura 3D molto simile e un pressoché identico meccanismo di reazione. La differenza fra questi enzimi è la specificità di substrato: La tripsina taglia i peptidi in corrispondenza di Lys e Arg La chimotripsina taglia i peptidi in corrispondenza di Trp, Phe, Tyr l'elastasi taglia i peptidi in corrispondenza di piccoli Aa idrofobici (Ala)

30 30 Le serino-proteasi di mammifero rappresentano un caso tipico di evoluzione divergente (derivano tutte da un progenitore comune). L'evoluzione divergente si è avuta per duplicazione genica e successive mutazioni puntiformi. La duplicazione genica permette al gene di svincolarsi dalla pressione selettiva e quindi può permettere ad una delle due copie di poter mutare e quindi evolversi evoluzione convergente la serino-proteasi del batterio è diversa come struttura 3D dalle serino-proteasi di mammifero ma ha la stessa specificità di substrato e lo stesso meccanismo catalitico. Organismi diversi partendo da una differente struttura 3D hanno evoluto proteine con una stessa funzione. Convergenza o divergenza? Si pensa ad una evoluzione divergente se la sequenza genica e la struttura delle proteine sono simili.

31 31 Evoluzione di proteine attraverso la fusione di frammenti genici Gli esoni possono corrispondere ad unità funzionali delle proteine (DOMINI). Nuove proteine (con nuove funzioni) possono risultare dalla ricombinazione di diversi esoni. Un fenomeno correlato è la ripetizione dello stesso dominio in una proteina (es domini ripetuti negli anticorpi e nella rodanasi) La rodanasi presenta 2 distinti domini con una struttura molto simile. Probabilmente si è evoluta per duplicazione genica di un dominio e successiva fusione dei 2 geni risultanti.

32 Il citocromo C è fra le proteine che più si sono conservate durante l'evoluzione 32

33 33 Struttura del citocromo C Sono particolarmente conservati durante l'evoluzione quei residui che servono per il legame del gruppo eme!!