Il metodo descritto in questa procedura consente la determinazione qualitativa dell RNA di Norovirus e/o del virus dell epatite A nel campione.

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1 DETERMINAZIONE DI NOROVIRUS ED HAV IN MOLLUSCHI BIVALVI MEDIANTE REAL TIME PCR INTRODUZIONE L epatite A (HAV) e i Norovirus (NoV) sono importanti agenti di infezioni umane virali a trasmissione alimentare. Non esistono attualmente metodi di routine per la coltura di questi virus dagli alimenti. La ricerca è pertanto basata sui metodi molecolari utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR), previa procedura di estrazione in grado di allontanare le sostanze inibenti la RT-PCR, eventualmente presenti nella matrice, producendo RNA altamente purificato. La determinazione può quindi essere effettuata tramite RT-PCR real-time, che verifica l amplificazione nel corso dei cicli di PCR misurando l eccitazione di molecole marcate con fluorofori. Nel saggio di real-time RT-PCR di tipo TaqMan, i fluorofori sono attaccati ad una sonda nucleotidica sequenza-specifica, che consente, simultaneamente, la conferma del templato target. Queste modifiche incrementano la sensibilità e la specificità del metodo di PCR ed eliminano la necessità di passaggi successivi alla PCR per la conferma del prodotto di amplificazione. Il metodo descritto in questa procedura consente la determinazione qualitativa dell RNA di Norovirus e/o del virus dell epatite A nel campione. 1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE DESCRIZIONE Questa procedura descrive tutte le fasi (rilascio, concentrazione, estrazione e rilevazione) di un metodo per la determinazione qualitativa dell RNA di HAV e NoV di genogruppo I (GI) e II (GII) nella matrice mollusco. Questa procedura applica una one-step TaqMan real-time RT-PCR. 2. NORMATIVE DI RIFERIMENTO ISO Microbiology of food and animal feeding stuffs Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens General requirements and definitions. ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological examinations. pag. 1 di 17

2 3. TERMINI E DEFINIZIONI 3.1. Virus dell epatite A (HAV) Il virus dell epatite A (HAV) è un membro della famiglia dei Picornaviridae responsabile per l epatite infettiva. Geneticamente l HAV può essere suddiviso in sei genotipi sulla basa della regione VP1/2A (i genotipi 1, 2 e 3 sono stati trovati nell uomo, mentre i genotipi 4, 5 e 6 sono relativi ai primati). Esiste un solo sierotipo. La trasmissione avviene per via oro-fecale con il contatto person-to-person, attraverso il consumo di alimenti contaminati o con il contatto con acqua o superfici destinate agli alimenti contaminate Norovirus (NoV) I Norovirus (NoV) sono membri della famiglia dei Caliciviridae responsabili di epidemie sporadiche di gastroenterite acuta. Geneticamente i NoV possono essere suddivisi in cinque genogruppi distinti. Tre di essi GI, GII e GIV sono stati implicati in casi di gastroenterite nell uomo. GI e GII sono responsabili per la vasta maggioranza dei casi clinici. La trasmissione ha luogo per via oro-fecale tramite contatto person-to-person, attraverso il consumo di alimenti contaminati o tramite contatto con acqua o superfici destinate agli alimenti contaminate Ricerca di virus dell Epatite A / Norovirus Determinazione qualitativa di RNA di HAV o NoV in una massa/volume predeterminato di alimento, effettuata in accordo con la presente procedura Controllo di Processo (CP) Un virus aggiunto alla porzione di campione prima dell estrazione, allo scopo di verificare l efficienza dell estrazione (quando si aggiunge al campione da analizzare il virus per il controllo di processo deve essere diverso dal virus target). Il virus selezionato come CP dovrebbe essere un virus coltivabile privo di envelop con RNA a singolo filamento positivo di dimensioni simili a quelle del virus target per provvedere un buon modello genetico, morfologico e fisico-chimico. Il CP dovrebbe esibire una persistenza nell ambiente simile a quella dei virus target. Esempi di virus utilizzabili come controlli di processo nella presente procedura includono, oltre all HAV (11), il cui uso è possibile laddove l HAV stesso non costituisca il target dell analisi, il virus Mengo (1) e il Calicivirus Felino (11) RNA del controllo di processo RNA estratto dal virus usato come controllo di processo. Viene utilizzato per la stima dell efficienza della procedura di estrazione. pag. 2 di 17

3 3.6. Controllo negativo di RT-PCR Campione di acqua per il controllo dei reagenti di RT-PCR Controllo esterno ad RNA (EC) RNA di riferimento con funzione di target per il saggio di real-time RT-PCR, e.g. appropriate diluizioni di un trascritto in vitro da plasmide contenente la sequenza del gene target o di un RNA estratto da virus coltivato (HAV e FCV) o da campione fecale contenente virus dello stesso genogruppo (NoV). Il confronto dei risultati ottenuti sul controllo esterno in presenza e in assenza del campione consente la determinazione dei livelli di inibizione della RT-PCR in ogni campione sotto test 3.8. Limite teorico di rilevazione (tlod) Livello che costituisce la più piccola quantità del target teoricamente rilevabile con il saggio. Esso corrisponde ad una copia del genoma per volume di RNA testato nel saggio ma può variare in relazione alla matrice e alla quantità di materiale di partenza. 4. PRINCIPIO I molluschi bivalvi costituiscono una matrice complessa, in cui i virus target possono essere presenti a basse concentrazioni. E pertanto necessario effettuare procedure di estrazioni e/o di concentrazione al fine di provvedere un substrato idoneo per le successive fasi analitiche. Per ottenere un RNA pulito e ridurre l effetto degli inibitori della PCR l agente caotropico guanidina tiocianato è utilizzato per rompere il capside virale e l RNA è assorbito su silice per subire purificazione attraverso diversi stadi di lavaggio. L RNA purificato è rilasciato dalla silice in un buffer prima della real-time RT-PCR. Questa procedura applica una one-step TaqMan real-time RT-PCR, in cui la retrotrascrizione e l amplificazione in PCR sono effettuate consecutivamente nella stessa provetta di reazione. La TaqMan real-time RT-PCR utilizza una breve sonda a DNA con una marcatura fluorescente (reporter) e con un assorbitore di fluorescenza (quencher) legati agli estremi opposti della sonda. La chimica del saggio assicura che man mano che la quantità di prodotto amplificato aumenta, la sonda venga idrolizzata e il segnale fluorescente del marcatore aumenti proporzionalmente. La fluorescenza può essere misurata ad ogni stadio dell amplificazione. Il primo punto della PCR in cui l amplificazione può essere rilevata è proporzionale alla quantità di templato iniziale, pertanto l analisi delle curve di fluorescenza consente anche la determinazione della quantità di sequenza target nel campione. A causa dei bassi livelli di templato virale spesso presenti negli alimenti e della diversità genetica dei ceppi dei virus target, la selezione di reagenti adatti allo scopo di una one-step real-time RT- PCR e TaqMan PCR primers and probes per i virus target è importante. pag. 3 di 17

4 5. REAGENTI 5.1. Generale Per le pratiche comuni di laboratorio, vedere ISO Proteinasi K (30U/mg) Per le modalità di preparazione vedi Appendice B (punto B.1) 5.3 Phosphate buffered saline (PBS) Per le modalità di preparazione vedi Appendice B (punto B.2) 5.4 Silice, buffer di lisi, di lavaggio e di eluizione per l estrazione dell RNA virale Tali reagenti devono consentire l estrazione dell RNA da 500 µl di estratto di campione, usando una lisi con tampone caotropico contenete guanidina tiocianato [3] e usando silice come substrato per il legame dell RNA. Successivamente ai trattamenti dell RNA legato alla silice con i buffer di lavaggio per rimuovere le impurità, l RNA deve essere eluito in 100 µl di buffer di eluizione. La preparazione dell RNA deve essere di una qualità e di una concentrazione adatta allo scopo della determinazione. 5.5 Acqua per biologia molecolare 5.6 TaqMan primers e sonde per la ricerca di HAV e Norovirus GI e GII I primer TaqMan e le sonde devono essere pubblicate in una rivista peer-reviewed e devono essere verificate per l uso rispetto a un vasto range di ceppi del virus target. I primers per la ricerca di HAV dovrebbero ricercare la regione non codificante al 5 del genoma. I primers per la ricerca dei Norovirus di genogruppo I e II dovrebbero ricercare la regione di giunzione fra ORF1 e ORF2 del menoma. (Appendice C) 5.7 TaqMan primers e sonde per la ricerca del virus controllo di processo I primer TaqMan e le sonde devono essere pubblicate in una rivista peer-reviewed e devono essere verificate per l uso rispetto al ceppo di virus utilizzato come controllo di processo. Devono inoltre dimostrare assenza di cross-reattività nei confronti dei virus target. pag. 4 di 17

5 5.8 Reagenti e Mastermix TaqMan per il virus target e per il controllo di processo I reagenti devono consentire l analisi di 5µl di RNA in 25µl di volume totale di reazione. Essi devono essere one-step TaqMan RT-PCR reagenti sufficientemente sensibili per la ricerca di livelli di RNA virale coerenti con la tipica contaminazione degli alimenti. I reagenti dovrebbero essere aggiunti nelle quantità specificate dai produttori per consentire la preparazione di 20µl di mastermix per reazione in un totale di 25µl di volume. La concentrazione ottimale di primer e probe dovrebbe essere determinata seguendo le raccomandazioni del produttore dei reagenti. (Appendice D) 5.9 Controllo di processo Il sovranatante della coltura cellulare del virus controllo di processo dovrebbe essere diluito di un fattore 10 in buffer idoneo, e.g. PBS. Questa diluizione è finalizzata alla rilevazione senza inibizioni del virus controllo di processo con tecnologia TaqMan, mantenendo tuttavia una concentrazione sufficiente per rilevare in maniera riproducibile la più bassa diluizione usata per l RNA del virus controllo di processo nella curva standard (10.2.1). Suddividere il sovranatante diluito della coltura cellulare (controllo di processo) in aliquote per singolo uso e conservare a - 80±5 C RNA controllo esterno Distinti RNA a singolo filamento purificati per ogni virus target dovrebbero essere utilizzati come controllo esterno. Suddividere le preparazioni di RNA (EC) diluito in aliquote per singolo uso e conservare congelate a temperatura 15 C. 6. APPARECCHIATURE Apparecchiature standard per i laboratori microbiologici (ISO 7218) e in particolare quanto segue: 6.1 Micropipette e puntali con vari range di volumi, e.g. 1000µl, 200µl, 20µl 6.2 Pipettatore automatico e pipette con vari range di volumi, e.g 25ml, 10ml, 5ml 6.3 Vortex 6.4 Microcentrifuga 6.5 Blocco riscaldante in grado di operare a 99±1.0 C 6.6 Bilancia tecnica in grado di operare con risoluzione di ±0.1 g 6.7 Incubatore con agitazione in gradi di operare a 37±1.0 C e 320±20 rpm, o equivalente (i.e. agitatore posto all interno di incubatore) 6.8 Bagnomaria in grado di operare a 60±1.0 C pag. 5 di 17

6 6.9 Centrifuga da banco e rotore in grado di operare a 4,000 x g con capacità di ospitare tubi da 15ml 6.10 Bisturi sterili 6.11 Guanti 6.12 Forbici 6.13 Pinze 6.14 Piastre Petri sterili 6.15 Tubi Falcon sterili 6.16 Eppendorf sterili 6.17 Apparecchio e materiali necessari per l estrazione dell RNA utilizzando silice e reagenti associati 6.18 Strumento di PCR real-time in grado di supportare una chimica di reazione TaqMan Consumabili associati alla real-time RT-PCR, e.g. piastre ottiche e tappi/film, adatti per l uso nell apparecchio di PCR adottato. 7. CAMPIONAMENTO E CAMPIONE Il campionamento non è parte di questa procedura. I molluschi bivalvi dovrebbero essere vivi o, se congelati, dovrebbero essere non danneggiati. Prima di effettuare l apertura dei molluschi, rimuovere fango eventualmente presente sulle valve. 8. PROCEDURA 8.1. Requisiti generali del laboratorio L estrazione dei campioni e la PCR dovrebbero essere effettuate in aree di lavoro separate come richiesto dalla ISO Estrazione del virus Selezionare un minimo di 10 individui per le specie più grandi (30 per vongole e specie più piccole) ed aprire le valve con un bisturi sterile o uno strumento equivalente. Proteggere la mano che tiene i molluschi con un guanto da lavoro di sicurezza. Dissezionare il tessuto digestivo (epatopancres) utilizzando pinzette e forbicine (o strumenti equivalenti) e trasferire il tessuto in una piastra Petri pulita. Prelevare una quantità non inferiore a 2.0 ± 0.2 g Sminuzzare finemente il tessuto utilizzando un bisturi pulito (o uno strumento equivalente) pag. 6 di 17

7 Trasferire una quantità pari a 2.0 ± 0.2 g di epatopancreas sminuzzato in una provetta da centrifuga (quando si vuole verificare l efficienza della procedura di estrazione aggiungere 10 ± 0.1 µl di controllo di processo diluito, alla concentrazione scelta secondo quanto riportato al paragrafo 10) Aggiungere 2.0±0.2 ml di soluzione di proteinasi K (0.1 mg/ml); mescolare bene. Incubare la provetta a 37.0 ± 1.0 C con agitazione (approx 320 rpm) per 60 ± 5 min. Effettuare una seconda incubazione ponendo la provetta in bagnomaria a 60.0 ± 2.0 C per 15 ± 1 min Centrifugare a 3000 g per 5 min ± 30 sec e trasferire il sovranatante in una nuova provetta Misurare e registrare il volume ottenuto e portare il campione al volume finale di 3.0 ± 0.3 ml mediante aggiunta di PBS sterile (ph 7.3). Utilizzare la sospensione per l estrazione dell acido nucleico. I campioni così estratti possono essere conservati a 20 C (o, preferibilmente, 80 C) fino al momento dell uso. 8.3 Estrazione dell RNA Per l estrazione degli acidi nucleici possono essere utilizzati differenti kit di estrazione commerciali (es. MiniMag - Nuclisens Magnetic Extraction kit (biomerieux); NucleoSpin RNA II Macherey-Nagel ecc ) A prescindere dalle prescrizioni del kit riguardo alle quantità di campione da analizzare è consigliabile utilizzare i volumi di campione e di eluizione sotto descritti: 1. Prelevare 500 ± 10 µl di campione (o tutto il campione se inferiore a 500 µl) e procedere all estrazione secondo le modalità definite dalla casa produttrice del kit di estrazione 2. Al termine della procedura fluire l RNA estratto in 100 ± 1 µl di buffer di eluizione 3. Aggiungere 100 unità di inibitore delle RNAsi e mescolare pipettando L RNA estratto dovrebbe essere conservato a 5±3 C per <24 h o 15 C per periodi più lunghi Real-time RT-PCR Requisiti generali I requisiti minimi per l amplificazione e la rilevazione di sequenze di acidi nucleici mediante realtime PCR sono definite nella ISO pag. 7 di 17

8 Allestimento della Real-time RT-PCR Preparare la mix di retrotrascrizione e PCR (one-step) utilizzando i materiali presenti nel kit RNA Ultrasense one-step qrt-pcr (Invitrogen ) Preparare una mix per la determinazione di ciascun target (NoV GI, NoV GII, HAV) in quantità sufficiente e allestire la piastra come segue: 1. i campioni da sottoporre ad analisi (5±0.1µl di RNA di campione/pozzetto) 2. un controllo negativo (5±0.1µl di acqua per biologia molecolare/pozzetto) 3. una controllo positivo (5±0.1µl di acqua e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA, i.e. appropriata diluizione di RNA estratto da campione fecale in cui sia stata riscontrata presenza di NoV del genogruppo in esame o RNA estratto da sospensione virale di HAV) 4. un controllo di inibizione (5±0.1µl di campione e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA, i.e. appropriata diluizione di RNA estratto da campione fecale in cui sia stata riscontrata presenza di NoV del genogruppo in esame o RNA estratto da sospensione virale di HAV) Aggiungere 20±0.5µl della relativa TaqMan mastermix ad ogni campione (la mastermix può anche essere aggiunta ai relativi pozzetti prima dell aggiunta del templato). 5. un controllo di processo, scelto tra quelli indicati al punto 3.4 da saggiare parallelamente tramite aggiunta di mix specifica. Questo controllo verrà aggiunto nel caso si voglia verificare l efficienza dell estrazione ad ogni analisi. Vedi Appendice D per i dettagli della mix di PCR adottata in questa procedura Amplificazione Chiudere tutti i pozzetti con tappi ottici o film adesivo. Sottoporre la piastra ad un ciclo di reazione comprendente uno stadio iniziale per la trascrizione inversa e almeno 45 cicli di PCR. La durata e le temperature di ogni step (retrotrascrizione, disattivazione della RT, denaturazione, annealing, estensione) dipenderà dai reagenti usati; essi dovrebbero essere basati sulle raccomandazioni del produttore ma possono essere ulteriormente ottimizzati. Vedi Appendice D per i dettagli della amplificazione adottata in questa procedura. pag. 8 di 17

9 Analisi dei dati di fluorescenza I requisiti minimi per l analisi dei dati di amplificazione sono definiti nella ISO Le curve di amplificazione dovrebbero essere analizzate utilizzando l approccio raccomandato dal produttore dell apparecchio di real-time PCR. Il valore soglia ( threshold ) dovrebbe essere settato in maniera tale da attraversare l area dove le curve di amplificazione (in rappresentazione logaritmica) sono parallele (fase esponenziale). Tutte le curve di amplificazione dovrebbero essere verificate per identificare falsi positivi (reazioni con valori di Ct non associati con amplificazione) causati da segnali di background alti o irregolari. Questo dovrebbe essere annotato e i risultati di ogni reazione condizionata in questo modo dovrebbero essere considerati negativi. In aggiunta tutte la curve di fluorescenza dovrebbero essere controllate per verificare che i valori di Ct generati dall analisi del software corrispondano alla fase esponenziale dell amplificazione (e che essa non sia distorta da rumore di fondo alto o irregolare). Laddove i valori di Ct siano distorti, i valori corretti vanno registrati in aggiunta al valore generato dal software. 9. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 9.1. Generale Ogni controllo (controllo esterno ad RNA, RNA del controllo di processo) possiede un proprio valore di Ct atteso valido o un range di valori accettabili, stabiliti in base ai saggi valutativi ( 10). Se i risultati osservati per i controlli differiscono da quelli attesi, i campioni potrebbero richiedere una ripetizione del test. I controlli negativi (acqua per biologia molecolare) dovrebbero sempre essere negativi. Se risultati positivi occorrono in questi controlli, ogni campione che presenta risultati positivi dovrebbe essere ritestato. I campioni in esame sono considerati positivi qualora presentino un Ct 44.0; i risultati sono considerati accettabili se il controllo positivo presenta un Ct 44.0 e i controlli negativi di estrazione e di RT-PCR presentano valori di Ct > Espressione dei Risultati I risultati positivi di ogni virus target dovrebbero essere espressi come presenza di genoma virale in 5 µl di estratto di epatopancreas di mollusco. Se il virus target non è rilevato i risultati dovrebbero essere espressi come non rilevato genoma virale in 5 µl di estratto di epatopancreas di mollusco. Se non è stato ottenuto un risultato valido, i risultati dovrebbero essere espressi come nessun risultato. pag. 9 di 17

10 10. SAGGI PER LA VALUTAZIONE DEL METODO Vengono riportati i saggi da eseguire prima dell applicazione del metodo su campioni da analizzare. Essi consentono: a) la valutazione dell efficienza dell amplificazione e della procedura di estrazione, da utilizzare come parametri di assicurazione della qualità e non per il calcolo dei risultati analitici. b) la scelta della concentrazione dell RNA EC da utilizzare nell applicazione del metodo. Questa deve fornire un valore di Ct rappresentativo rispetto a quelli ottenuti dai campioni naturalmente contaminati c) la scelta della concentrazione del CP da utilizzare durante l applicazione del metodo d) il calcolo dei valori di Ct con le relative deviazioni standard (DS) di riferimento per i controlli adottati (RNA-EC, CP) da considerare nella interpretazione dei risultati ad ogni applicazione del metodo. I saggi per la valutazione delle efficienze di cui al punto a) dovrebbero essere ripetuti ad intervalli regolari tra determinazioni omogenee (stessa matrice, stesso parametro da ricercare) 10.1 Analisi del virus target Preparare diluizioni 10-1, 10-2 and 10-3 in acqua per biologia molecolare del controllo esterno ad RNA. Per ogni campione preparare: - 1 pozzetto nella piastra ottica con 5±0.1µl di RNA di campione - 1 pozzetto con 5±0.1µl di estratto di campione e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA non diluito Per la curva standard del controllo esterno ad RNA preparare: - 1 pozzetto con 5±0.1µl di acqua per biologia molecolare e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA non diluito - 1 pozzetto con 5±0.1µl di acqua per biologia molecolare e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA diluito pozzetto con 5±0.1µl di acqua per biologia molecolare e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA diluito 10-2 pag. 10 di 17

11 Per i controlli negativi preparare: - 1 pozzetto con 5±0.1µl di acqua per biologia molecolare Aggiungere 20±0.5µl della relativa TaqMan mastermix ad ogni campione (la mastermix può anche essere aggiunta nei relativi pozzetti prima dell aggiunta del templato) Analisi del controllo di processo Immediatamente prima di processare un gruppo di campioni, unire insieme un numero di aliquote di controllo di processo sufficiente per la verifica di ogni campione (10µl per campione più 25µl di eccesso). Diluire un aliquota di 20±0.5µl di controllo di processo in rapporto 1:10 utilizzando acqua per biologia molecolare e conservare a 5±3ºC per un massimo di 24 ore o in aliquote per singolo uso a una temperatura 15ºC per periodi più lunghi. Riscaldare a 99±2ºC per 5 min ± 30 sec utilizzando un blocco scaldante o apparecchiatura equivalente in modo da rilasciare l RNA. Raffreddare i tubi rapidamente, centrifugare a 3000 x g per 1min, quindi trasferire il sovranatante ( RNA del controllo di processo ) in un nuovo tubo. Preparare in acqua per biologia molecolare diluizioni 10-1, 10-2 e 10-3 dell RNA del controllo di processo. Per ogni campione, a cui è stato aggiunto il CP prima del trattamento con proteinasi K, preparare: - 1 pozzetto con 5±0.1µl di RNA di campione Per la curva standard dell RNA del controllo di processo preparare: - 1 pozzetto con 5±0.1µl di RNA del controllo di processo diluito pozzetto con 5±0.1µl di RNA del controllo di processo diluito pozzetto con 5±0.1µl di RNA del controllo di processo diluito 10-3 Per i controlli negativi preparare: - 1 pozzetto con 5±0.1µl di acqua per biologia molecolare Aggiungere 20±0.5µl della relativa TaqMan mastermix ad ogni campione (la mastermix può anche essere aggiunta ai relativi pozzetti prima dell aggiunta del templato). pag. 11 di 17

12 10.3 Valutazione delle efficienze di reazione Curve standard Controllare i valori di Ct di tutte le serie di diluizioni delle curve standard (RNA del controllo di processo, RNA del controllo esterno) per tutti i punti che non cadono in prossimità della linea del best fit. Questi valori non dovrebbero essere incorporati nel calcolo della curva standard. Utilizzare i rimanenti valori per creare la curva standard. Curve con valori di r 2 dovrebbero essere usate per i calcoli. <0.98 non Calcolo dell efficienza di amplificazione Verificare il valore di Ct per il campione nei pozzetti con RNA del controllo esterno. Usare questo valore per stimare l efficienza di amplificazione facendo riferimento alla curva standard del controllo esterno ad RNA. Si considera accettabile un efficienza di amplificazione >50% Calcolo dell efficienza di estrazione Verificare il valore di Ct per il controllo di processo dai pozzetti con RNA dei campioni. Usare questi valori per stimare il recupero del controllo di processo facendo riferimento alla curva standard dell RNA del controllo di processo. Per i molluschi bivalvi calcolare l efficienza di estrazione dividendo il recupero per 0.5 e moltiplicando per il volume totale di omogenato alla fine dell estrazione (3 ml). Si considera accettabile un efficienza di estrazione >1% Limite teorico di rilevazione La quantità minima teorica di target rilevabile nel campione con questa procedura è 10 copie di genoma. Per i campioni di molluschi il limite teorico di rilevazione (tlod) si ottiene dividendo tali valori per 0.5 e moltiplicando per il volume totale di omogenato misurato alla fine dell estrazione (3 ml). pag. 12 di 17

13 Appendice A BIBLIOGRAFIA [1] Costafreda MI, Bosch A, Pintó RM Development, evaluation, and standardization of a real-time TaqMan reverse transcription-pcr assay for quantification of hepatitis A virus in clinical and shellfish samples. Appl Environ Microbiol. 72(6): [2] Lowther JA, Henshilwood K, Lees DN Determination of norovirus contamination in oysters from two commercial harvesting areas over an extended period, using semiquantitative realtime reverse transcription PCR. J Food Prot. 71(7): [3] Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28(3): [4] da Silva AK, Le Saux JC, Parnaudeau S, Pommepuy M, Elimelech M, Le Guyader FS Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using Real-Time Reverse Transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II. Appl Environ Microbiol. 73(24): [5] Svraka S, Duizer E, Vennema H, de Bruin E, van der Veer B, Dorresteijn B, Koopmans M Etiological role of viruses in outbreaks of acute gastroenteritis in The Netherlands from 1994 through J Clin Microbiol. 45(5): [6] Loisy F, Atmar RL, Guillon P, Le Cann P, Pommepuy M, Le Guyader FS Real-time RT- PCR for norovirus screening in shellfish. J Virol Methods. 123(1):1-7. [7] Kageyama T, Kojima S, Shinohara M, Uchida K, Fukushi S, Hoshino FB, Takeda N, Katayama K Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-pcr. J Clin Microbiol. 41(4): [8] Le Guyader FS, Parnaudeau S, Schaeffer J, Bosch A, Loisy F, Pommepuy M, Atmar RL Detection and quantification of norovirus in shellfish. Appl Environ Microbiol. 75: [9] Pintó, R.M., M.I. Costafreda, E. Ribes, and A. Bosch From quantitative risk-assessment to risk management in shellfish-borne outbreaks of hepatitis A. manuscript submitted to Appl Environ Microbiol). [10] Martin LR, Duke GM, Osorio JE, Hall DJ, Palmenberg AC Mutational analysis of the mengovirus poly(c) tract and surrounding heteropolymeric sequences. J Virol. 70(3): [11] Di Pasquale S., Paniconi M. De Medici D., Suffredini E. and Croci L Duplex Real Time PCR for the detection of Hepatitis A virus in shellfish using Feline Calicivirus as a process control. J Virol. Meth. (in press) pag. 13 di 17

14 Appendice B B.1 Soluzione di proteinasi K B.1.1 Composizione Proteinasi K (30U/mg) Acqua per biologia molecolare 20±0.1mg 200±2ml B.1.2 Preparazione Dissolvere la Proteinasi K in acqua. Mescolare accuratamente. Conservare in volumi adatti al consumo a -20±5ºC per un massimo di 6 mesi. Una volta scongelata conservare a 4±2ºC e usare entro una settimana. B.2 Phosphate buffered saline (PBS) B.2.1 Composizione NaCl 8.0±0.1g B.8.2 Cloruro Preparation di potassio 0.2±0.01g Mix Disodio the components idrogno fosfato together, adjust the ph, if necessary, 1.15±0.01g to 7.3±0.2 at. Proteinase Potassio diidrogeno K solution fosfato 0.2±0.01g Acqua per biologia molecoalre 1000±2ml B.2.2 Preparazione Dissolvere le polveri in acqua, aggiustare il ph, se necessario, a 7.3±0.2 a 25ºC. Sterilizzare in autoclave. pag. 14 di 17

15 Appendice C Primers e sonde TaqMan per la rilevazione di HAV, Norovirus GI e GII HAV HAV68 (FW): TCA CCG CCG TTT GCC TAG [1] HAV240 (REV): GGA GAG CCC TGG AAG AAA G [1] HAV150(-) (PROBE): CCT GAA CCT GCA GGA ATT AA [1] Sonda marcata 5 6-carboxyfluorescein (FAM), 3 MGB (minor groove binder) L allineamento di sequenze usando tutte le sequenze disponibili in GenBank per la regione target dimostra che questo set di primer/probe è adeguato per la rilevazione di tutti i genotipi. In aggiunta l analisi di quasispecie dello spettro di mutanti indica che questa regione non è prona alla variabilità e che questo saggio dovrebbe possedere robustezza a lungo termine. La specificità dei primers è stata verificata con 10 differenti Picornavirus: poliovirus (sierotipo 1 ceppo vaccinale), human enterovirus B (echovirus 1), human enterovirus B (echovirus 11), human enterovirus B (echovirus 30), human enterovirus B (coxsackievirus-b5), human enterovirus C (coxsackievirus-a24), human enterovirus D (enterovirus 70), bovine enterovirus, porcine teschovirus (porcine enterovirus 1) e encephalomyocarditis virus, ed altri virus enterici come hepatitis E virus, human and porcine rotavirus (group A), norovirus, mamastrovirus (human astrovirus type 1) e human adenovirus F (enteric adenovirus type 40). Nessuno dei virus testati ha dato risultati positivi né ad alte concentrazioni ( TCID50/ml o sospensioni fecali al 10%) o basse concentrazioni (10 4 TCID50/ml o diluizioni 1/10 di sospensioni fecali al 10%). Il LOD del saggio è 10 molecole ssrna, 1 molecola di RNA virale e 0.05 virus infettanti per reazione [1]. Norovirus GI QNIF4 (FW): CGC TGG ATG CGN TTC CAT [4] NV1LCR (REV): CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC [5] NVGG1p (PROBE): TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT [5] Probe labelled 5 6-carboxyfluorescein (FAM), 3 6-carboxy-tetramethylrhodamine (TAMRA) D.3 Norovirus GII QNIF2 (FW): ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA [6] COG2R (REV): TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA [7] QNIFS (PROBE): AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG [6] Probe labelled 5 6-carboxyfluorescein (FAM), 3 6-carboxy-tetramethylrhodamine (TAMRA) L area selezionata per la ricerca dei Norovirus è la regione fortemente conservata all estremità 5' pag. 15 di 17

16 dell ORF2 [7]. L allineamento di sequenze utilizzando tutte le sequenze disponibili in GenBank per la regione target dimostra che questo set di primer/probe è adeguato per la ricerca di tutti i Norovirus di GI e GII rispettivamente. In aggiunta l efficacia e la sensibilità di primers e probe è stata verificata usando 18 ceppi di riferimento di NoV: GI.1 (Norwalk virus), GI.2 (Whiterose), GI.3 (Southampton), GI.4 (Malta), GI.5 (Musgrove), GI.6 (Mikkeli), GI.7 (Winchester), GI.10 (Boxer), GII.1 (Hawaii), GII.2 (Melksham), GII.3 (Toronto), GII.4 (Grismby), GII.6 (Seacroft), GII.7 (Leeds), GII.10 (Erfurt), le varianti GIIb e GIIc e GIV (Alphatron). La specificità dei primers è stata verificata verso 6 virus enterici umani: poliovirus (sierotipo 1 ceppo vaccinale), hepatitis A virus, hepatitis E virus, Aichi virus, astrovirus and rotavirus. La specificità è sata inoltre testata su 7 batteri che possono essere rtrovati nei molluschi: Escherichia coli, Shewenella putrefaciens, Chromobacterium violaceum, Aeromonas sobria, Vibrio alginolyticus, Vibrio paraheamolyticus e Vibrio cholerae). Nessuno dei virus testati o dei batteri hanno dato risultati positivi. Il LOD dei saggi è da 1 a 10 molecole virali di RNA (a seconda del ceppo di NoV) [6,8]. pag. 16 di 17

17 Appendice D Composizione delle one-step TaqMan real-time RT-PCR mastermix utilizzando il kit Invitrogen RNA Ultrasense One-step qrt-pcr system e parameters di amplificazione D.1 Mastermix Reagenti Concentrazione finale (in 25µl) Volume per reazione (µl) 5 x Ultrasense reaction mix 1 x 5,0 FW Primer (12,5 µm) 500 nm 1,0 REV Primer (22,5 µm) 900 nm 1,0 Probe (6,25 µm) 250 nm 1,0 Rox reference dye (50x) 1 x a 0,5 RNA Ultrasense enzyme mix - 1,25 Acqua per biologia molecolare - 10,25 Volume totale - 20±0,2 a Con apparecchiature di real-time PCR della Applied Biosystems, ROX dovrebbe essere utilizzato ad una concentrazione 1 x; per apparecchi Stratagene (i.e. MX3000), ROX può essere usato a concentrazione 0.1 x, o può essere tralasciato dalla mastermix. Per altri produttori consultare le istruzioni dell apparecchio. D.2 Parametri di amplificazione Step Temperatura e tempo Numero di cicli Acquisizione Retrotrascrizione 55 C per 1 h 1 no Preriscaldamento 95 C per 5 min 1 no Amplificazione Denaturazione 95 C per 15 s no Annealingextension 60 C per 1 min 45 no 65 C per 1 min si (singola) pag. 17 di 17

18 DETERMINAZIONE DI NOROVIRUS ED HAV IN MOLLUSCHI BIVALVI MEDIANTE REAL TIME PCR CORREZIONI E INTEGRAZIONI AL TESTO 6.9: in luogo di Centrifuga da banco e rotore in grado di operare a 4,000 x g inserire Centrifuga da banco e rotore in grado di operare a x g punto 4: in luogo di un controllo di inibizione inserire un controllo di inibizione per ciascun campione 9.1 ultimo paragrafo: in luogo di i controlli negativi di estrazione e di RT-PCR inserire i controlli negativi di RT-PCR 10 punto d : in luogo di riferimento per i controlli adottati (RNA-EC, CP) inserire riferimento per i controlli adottati (RNA-EC) 10.1 primo paragrafo: in luogo di Preparare diluizioni 10-1, 10-2 and 10-3 in acqua inserire Preparare diluizioni 10-1 e 10-2 in acqua ultimo paragrafo: in luogo di Si considera accettabile un efficienza di amplificazione >50%. inserire Si considera accettabile un efficienza di amplificazione 50%. Determinazioni con efficienza di amplificazione inferiore sono considerate accettabili qualora la ricerca del parametro target abbia dato esito positivo ultimo paragrafo: in luogo di Si considera accettabile un efficienza di estrazione >1%. inserire Si considera accettabile un efficienza di estrazione 1%. Determinazioni con efficienza di estrazione inferiore sono considerate accettabili qualora la ricerca del parametro target abbia dato esito positivo. pag. 1 di 4

19 INTEGRAZIONI ALLA PROCEDURA 1. Formule per il calcolo dell efficienza di amplificazione ( ) L efficienza di amplificazione della reazione di PCR è calcolata mediante la curva standard della reazione. La formula di calcolo è: E = (10-1/slope ) 1 dove lo slope è il coefficiente angolare della curva standard. L efficienza di amplificazione per il target nelle reazioni effettuata sul campione in analisi è calcolata mediante confronto del Ct ottenuto dal campione addizionato di controllo esterno con il Ct del solo controllo esterno (alla medesima diluizione). La formula di calcolo è: E = 2 - Ct dove Ct = Ct campione Ct standard 2. Formule per il calcolo dell efficienza di estrazione ( ) L efficienza dell estrazione è calcolata mediante confronto del Ct ottenuto dal campione con il Ct del controllo di processo. La formula di calcolo è: R = 2 - Ct * 0.6 dove Ct = Ct campione Ct standard alla diluizione 10-1 Il fattore 0.6 tiene conto della frazione di campione sottoposta ad estrazione degli acidi nucleici ( 8.3) nota: in alternativa, qualora i risultati ottenuti non consentissero il calcolo sopra descritto è possibile stimare il recupero come segue: R = 2 - Ct * 0.06 dove Ct = Ct campione Ct standard alla diluizione 10-2 pag. 2 di 4

20 3. Esempio caricamento campioni e controlli 3.1 Piastra contente campioni, controlli di amplificazione e controlli di estrazione per ciascun campione, curve standard per la valutazione delle efficienze di ciascuna amplificazione Tale modalità di caricamento della piastra consente il calcolo dell efficienza di amplificazione (i.e. presenza di inibenti) e dell efficienza di estrazione (i.e. recupero) per ciascun campione e la verifica dell efficienza delle reazioni predisposte (amplificazione del target e del controllo di processo). 3.2 Piastra contente campioni, controlli di amplificazione e controlli di estrazione per ciascun campione pag. 3 di 4

21 Tale modalità di caricamento della piastra consente il calcolo dell efficienza di amplificazione (i.e. presenza di inibenti) e dell efficienza di estrazione (i.e. recupero) per ciascun campione. La verifica dell efficienza delle reazioni (amplificazione del target e del controllo di processo) verrà effettuata periodicamente. 3.3 Piastra contente campioni e controlli di amplificazione per ciascun campione Tale modalità di caricamento della piastra consente il calcolo dell efficienza di amplificazione (i.e. presenza di inibenti) per ciascun campione. La verifica dell efficienza del processo di estrazione e dell efficienza delle reazioni (amplificazione del target e del controllo di processo) verrà effettuata periodicamente. pag. 4 di 4

22 ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Direttore: dott.ssa Luciana Croci DICHIARAZIONE DI VALIDAZIONE OGGETTO: Metodo per la ricerca di epatite A e Norovirus in alimenti mediante Real- time PCR CAMPO DI APPLICAZIONE: molluschi lamellibranchi Il metodo in oggetto è stato sottoposto a validazione presso il Laboratorio Nazionale di Riferimento (LNR) per le contaminazioni virali dei molluschi bivalvi e dichiarato idoneo all uso in data REQUISITI : A. Determinazione HAV Sensibilità (inclusività della PCR): 100% Specificità (esclusività della PCR): 100% Efficienza PCR: >95% tlod: 10 copie genomiche/5 µl di estratto di epatopancreas B. Determinazione NoV GI Sensibilità (inclusività della PCR): 100% Specificità (esclusività della PCR): 100% Efficienza PCR: >95% tlod: 10 copie genomiche/5 µl di estratto di epatopancreas C. Determinazione NoV GII Sensibilità (inclusività della PCR): 100% Specificità (esclusività della PCR): 100% Efficienza PCR: >95% tlod: 10 copie genomiche/5 µl di estratto di epatopancreas Pag. 1 di 2

23 ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Direttore: dott.ssa Luciana Croci D. Determinazione controllo di processo (Mengovirus) Sensibilità (inclusività della PCR): 100% Specificità (esclusività della PCR): 100% Efficienza PCR: >95% tlod: 10 copie genomiche/5 µl di estratto di epatopancreas Recupero 1% Roma Il Responsabile del LNR per le Dr.ssa Luciana Croci Pag. 2 di 2

24 ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Direttore: dott.ssa Luciana Croci Corrispondenze fra protocollo DETERMINAZIONE DI NOROVIRUS ED HAV IN MOLLUSCHI BIVALVI MEDIANTE REAL TIME PCR e successive integrazioni/correzioni formulato dal LNR per il controllo delle contaminazioni virali dei molluschi bivalvi su mandato del Ministero della Salute (novembre 2009) e la POMIAC protocollo DETERMINAZIONE DI NOROVIRUS ED HAV IN MOLLUSCHI BIVALVI MEDIANTE REAL TIME PCR (novembre 2009) POMIAC Introduzione Introduzione 1. Scopo e campo di applicazione 1. Scopo e campo di applicazione 2. Normative di riferimento 2. Normative di riferimento 3. Termini e definizioni 3. Termini e definizioni specifiche operative in evidenza: - controllo di processo (cfr ) - controllo esterno ad RNA (cfr ) 4. Principio 4. Principio 5. Reagenti 5. Reagenti specifiche operative in evidenza: - indicazione delle modalità di estrazione dell RNA (riferimento ad Appendice C) e e Apparecchiature 6. Apparecchiature 7. Campionamento e campione 7. Campionamento pag. 1 di 3

25 ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Direttore: dott.ssa Luciana Croci 8. Procedura 8. Procedura specifiche operative in evidenza: - utilizzo del controllo di processo in ciascun campione (cfr ) - utilizzo della curva standard del controllo esterno a RNA (cfr ) Analisi del virus target (inclusa curva standard del controllo esterno a RNA) e Analisi del controllo di processo Interpretazione dei risultati 9. Interpretazione dei risultati specifiche operative in evidenza: - utilizzo dell efficienza di amplificazione (cfr. 9.2) e dell efficienza di estrazione (cfr. 9.3) come parametri di assicurazione della qualità del dato analitico Saggi per la valutazione del metodo Gli elementi descritti sono integrati nella procedura ed eseguiti contestualmente al processo analitico e Appendice A Appendice A pag. 2 di 3

26 ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Direttore: dott.ssa Luciana Croci Appendice B Appendice C Appendice D Appendice B Appendice C specifiche operative in evidenza: - include istruzioni sulle modalità di estrazione dell RNA Appendice D specifiche operative in evidenza: - include istruzioni per la determinazione del controllo di processo Appendice E Appendice F ed G [omissis] specifiche operative in evidenza: - include istruzioni per la produzione dei controlli esterni ad RNA nota: I controlli esterni ad RNA sono forniti agli Istituti richiedenti dall LNR per le Appendice H specifiche operative in evidenza: - include istruzioni per l interpretazione dei dati di fluorescenza sullo strumento di PCR real-time in dotazione all LNR per le contaminazioni virali dei molluschi bivalvi Appendice J specifiche operative in evidenza: - include istruzioni per la costruzione delle curve standard, per il calcolo dell efficienza di amplificazione e per il calcolo dell efficienza di estrazione pag. 3 di 3