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1 Metodi analitici per la ricerca dei virus enterici negli alimenti Elisabetta Suffredini Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Tor Vergata Roma - La Sapienza DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma 1

2 Virus enterici trasmessi da alimenti Virus che causano gastroenteriti: t Rotavirus, Adenovirus tipo 40 e 41 e i Calicivirus (NoV e SaV) Virus dell epatite entericamente trasmessa: HAV e HEV Virus che si replicano nell intestino umano, ma che causano malattia dopo essere migrati in altri organi, come il sistema nervoso centrale o il fegato: Enterovirus Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 2

3 VIRUS - caratteristiche r Oltre 120 tipi di virus enterici Irregolarmente sferici, diametro variabile da 25 nm (Picornavirus) rus) a 75 nm (Rotavirus) Singola catena ad RNA, doppia catena ad RNA (Rotavirus), doppia catena DNA (Adenovirus) Specificità d ospite Infettività variabile (dose infettante generalmente unità virali; eliminati con le feci in grande quantità ( /g) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 3

4 Regolamento (CE) 2073/2005 consideranda N 22: I criteri microbiologici fissati nel presente regolamento devono poter essere riveduti e modificati, se necessario, per tenere conto dell evoluzione nei settori della sicurezza alimentare e della microbiologia o og degli alimenti, ossia dei progressi scientifici, tecnologici e metodologici, dei cambiamenti nei livelli di prevalenza e contaminazione e nella percentuale di consumatori sensibili, nonché degli eventuali risultati che emergono dalla valutazione dei rischi. Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 4

5 N 23: Regolamento (CE) 2073/2005 consideranda In particolare, è opportuno che i criteri per i virus patogeni nei molluschi bivalvi vivi siano fissati quando i metodi d analisi i sono stati sufficientemente i messi a punto. Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 5

6 Metodi di ricerca dei virus Microscopia i elettronica Saggi immunoenzimatici (ELISA) Colture cellulari Metodi molecolari Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 6

7 Metodi di ricerca dei virus HEV Microscopia M croscop a elettronica ttron ca HAV AdV RV AV Istituto Superiore di Sanità - Roma NoV DSPVSA 7

8 Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità ità / economicità ità scarsa sensibilità ELISA individuazione solo di alcuni ceppi virali praticità scarsa sensibilità (RT)-PCR individuazione id i solo di alcuni ceppi virali rt-(rt)-pcr sensibilità colture 10 0 non disponibili tutti i virus cellulari scarsa praticità Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 8

9 Metodi di ricerca dei virus ELISA / sist. st. immunoenzimatici nz mat Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 9

10 Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità ità / economicità ità scarsa sensibilità ELISA individuazione solo di alcuni ceppi virali praticità scarsa sensibilità (RT)-PCR individuazione id i solo di alcuni ceppi virali rt-(rt)-pcr sensibilità colture 10 0 non disponibili tutti i virus cellulari scarsa praticità Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA10

11 Metodi di ricerca dei virus (RT)-PCR convenzionale nz ona o real-time tm Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA11

12 Metodi di ricerca dei virus (RT)-PCR convenzionale nz ona o real-time tm Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA12

13 Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità ità / economicità ità scarsa sensibilità ELISA individuazione solo di alcuni ceppi virali praticità scarsa sensibilità (RT)-PCR individuazione id i solo di alcuni ceppi virali rt-(rt)-pcr sensibilità colture 10 0 non disponibili tutti i virus cellulari scarsa praticità Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA13

14 Metodi di ricerca dei virus Colture o tur c cellulari u ar AdV HAV Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA14

15 Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità / economicità scarsa sensibilità ELISA individuazione solo di alcuni ceppi virali elevata praticità scarsa sensibilità (RT)-PCR individuazione solo di alcuni ceppi virali rt-(rt)-pcr elevata sensibilità colture 10 0 non disponibili per tutti i virus cellulari scarsa praticità iià verifica infettività Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA15

16 Metodi di ricerca dei virus Microscopia i elettronica Sensibilità Saggi immunoenzimatici (ELISA) Matrice Colture cellulari Virus difficilmente o affatto coltivabili Metodi molecolari METODO DI ELEZIONE Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA16

17 Metodi: Metodi: CEN/TC275/WG6/TAG4 2004: istituzione del gruppo CEN/TC275/WG6/TAG4 Horizontal method for detection of Norovirus and Hepatitis A virus in food by RT-PCR (ISO e ) Definizione metodi di riferimento per NV (GGI e GGII) e HAV: Superfici Frutta e vegetali Acqua Molluschi bivalvi Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA17

18 Applicazione della PCR su matrici alimentari Natura complessa e non omogenea del campione Basso numero di virus presenti Concentrazione del virus (matrice-dipendente) Estrazione e purificazione i NA (rimozione i inibenti) ib (Retrotrascrizione t i e) PCR (sensibilità & specificità) ità) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA18

19 PCR su matrici alimentari: trattamento del campione Natura complessa e non omogenea del campione Basso numero di microrganismi presenti Concentrazione del virus (matrice-dipendente) > differenza con le altre analisi molecolari > differenza con le altre analisi microbiologiche colturali Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA19

20 PCR su matrici alimentari: trattamento del campione > Soft fruits & vegetables: riduzione i piccoli pezzi, lavaggio con tampone (controllo del ph), centrifugazione, PEG, centrifugazione > Acqua in bottiglia: filtrazione, lavaggio filtro e contenitore (controllo ph), centrifugazione i > MBV: dissezione tessuto, omogenizzazione, digestione, centrifugazione Fino al 70% del tempo analitico nella preparazione del campione > organizzazione & automazione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA20

21 PCR su matrici alimentari: trattamento del campione recupero HAV NoV GI NoV GII lab L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 L2 L3 L4 L5 L6 S1 S ref Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA21

22 PCR su matrici alimentari: trattamento del campione Utilizzo di un controllo di processo (virus) Calcolo del recupero dalla matrice, valutazione dell efficacia del processo di estrazione e concentrazione del virus Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA22

23 PCR su matrici alimentari: estrazione degli AN Varietà delle matrici Volumi Target (DNA/RNA) Automazione Estrazione e purificazione AN (rimozione inibenti) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA23

24 PCR su matrici alimentari: estrazione degli AN Frutta e vegetali: Molluschi: fenoli glicogeno g polisaccaridi polisaccaridi pectina alghe polifenoli xylano Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA24

25 PCR su matrici alimentari: estrazione degli AN > Sistema di estrazione: guanidina tiocianato + silice, Vol estraibile/vol eluizione HAV NoV GI NoV GII ext L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 1 64% 44% 131% 101% 102% 7% 35% 120% 123% 74% 74% 53% 29% 84% 11% 6% 1% 1% 0% 9% 1% Avg : 51% (range <1-131) 84% 32% 42% 68% 37% 91% 97% 9% 7% 13% 7% 15% 18% 16% 5% 2% 7% 2% 2% 0% 11% NT NT NT NT NT NT Avg : 69% (range 44-99) Avg : 79% (range ) NT 69% 77% 77% 82% 83% 78% 86% 107% 104% 88% 115% 116% 72% 66% 2 96% 61% 90% 56% 66% 48% 84% 88% 68% 49% 61% 93% 60% 76% 89% 45% 99% 44% 56% 59% 56% % 149% 105% 97% 87% 63% 83% 145% 139% 141% 120% 128% 17% 50% 104% 101% 89% 99% 117% 40% 50% 81% 70% 76% 87% 73% 10% 87% 98% 100% 66% 53% 10% 80% 100% 29% 40% 27% 29% 87% 27% 62% Avg : 101% (range ) 147% 163% 165% 112% 68% 80% 105% 88% 129% 118% 153% 94% 81% 66% 91% 87% 107% 90% 94% 109% 125% 86% 53% 109% 50% 83% 111% 86% 81% 153% 77% 99% 101% 94% 105% 82% 71% 90% 132% 100% 130% 108% ref 96% 105% 106% 102% 110% 82% 52% 87% 97% 103% 105% 106% 121% 102% 102% 112% 108% 115% 103% 104% 63% Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA25

26 PCR su matrici alimentari: estrazione degli AN Utilizzo di un controllo esterno di amplificazione (RNA di sintesi) Calcolo dell efficienza di amplificazione, valutazione dell efficacia del processo di estrazione degli acidi nucleici e rimozione degli inibenti Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA26

27 PCR su matrici alimentari: amplificazione Varianti genetiche Livelli di contaminazione Amplificazione (inclusività e sensibilità) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA27

28 Metodi di PCR adottati per la determinazione i di virus enterici i nei molluschi PubMed review (2010): NoV 70 HAV 55 Enteric viruses 46 Enterovirus 36 Adenovirus 14 Rotavirus 14 Astrovirus 11 HEV 2 Aichivirus 1 > Scelta real-time > Definizioni regioni da amplificare Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA28

29 GIII GI GII Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA29

30 Retrotrascrizione e PCR: one-step TaqMan probes: FAM-TAMRA (NoV) GI - GII FAM-MGB (HAV) NoV 5 VPG ORF 1 ORF 2 ORF 3 AAA3 NV Proteine non strutturali (hel-prot-polimerasi) Proteina capsidica Proteina strutturale Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA30

31 PCR su matrici alimentari: amplificazione > primers/probe pubblicati > inclusività (sulle varianti) DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma 31

32 PCR su matrici alimentari: amplificazione > primers/probe pubblicati > inclusività (sulle varianti) > esclusività (altri virus incluso controllo di processo flora microbica) > LOD (kit per analisi clinica vs. analisi su alimenti) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA32

33 PCR per la ricerca/quantizzazione di virus in matrici alimentari: workflow metodo analitico Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA33

34 NoV Controllo processo Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA34

35 Efficienza di estrazione: controllo di processo Caratteristiche: - Virus coltivabile - Caratteristiche strutturali simili al target - Non presente naturalmente nella matrice - Assenza di interferenza nelle PCR Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA

36 virus virus process control Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA36

37 Controllo di processo / recupero 5 l campione vs. 5 l virus CP Ct = Ct camp Ct virus CP R = 2 - Ct x d Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA

38 process control recupero dal campione Stima della quantità di virus nel campione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA38

39 Efficienza di estrazione NA: controllo di inibizione Caratteristiche: -Sequenza target - Acidi nucleici di sintesi (puri) - Quantizzato/quantizzabile Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA

40 plasmide con inserto di sintesi promotore RNA polimerasi estrazione del plasmide con inserto trasformazione E. coli coltura Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA

41 sito di taglio enzimaico i linearizzazione del plasmide standard a RNA trascrizione in vitro seq a RNA digestione DNA quantizzazione spettrofotometrica Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA

42 virus virus process control Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA42

43 Controllo di inibizione / efficienza di PCR 5 l H 2 O vs. + 1 l RNA EC 1 l RNA-EC 5 l campione + 1 l RNA-EC Ct = Ct camp Ct stand E = 2 - Ct Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA

44 virus efficienza della PCR Stima della quantità di virus nel campione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA44

45 Determinazione del target Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA

46 virus virus process control Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA46

47 virus virus virus process control numero di copie del target analizzato + efficienza della PCR + recupero dal campione Stima della quantità di virus nel campione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA47

48 ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA VENETO (Northern Adriatic sea) Year Species n HAV (%) NoV (%) Tapes Mytilus Crassostrea (70) (45.8) 14 (60.9) 11 (45.8) (51 4) (70) (51.4) NoV results are considered as presence of either GI or GII copies/g Mytilus (n=14) Tapes (n=11) Crassostrea (n=11) MIN 4,8E+01 * 1,4E+01 * 1,5E+02 MAX 3,1E+04 1,4E+05 2,2E+04 geom MEAN 1,8E+03 4,9E+03 2,0E+03 range (geom mean±ds) 4,7E+01 1,1E+04 3,3E+02 7,4E+04 4,2E+02 9,6E+03 NoV results are considered as sum of GI and GII ; * estimated values (LOQ GI: copies/g; LOQ GII: copies/g) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA48

49 ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA GULF OF NAPLES (Thyrrenian sea) Year Species n NoV (%) Mytilus class A Mtil Mytilus class B Mytilus retailers * others retailers * (=163) 13 (22.4) 47 (79.7) 7) 27 (77.1) 7 (63.6) NoV results are considered as presence of either GI or GII ; * registered + street vendors Years copies/g Mtil Mytilus cl.a la Mtil Mytilus cl.b lb (n=6) (n=21) Mytilus retailers (n=25) others retailers til (n=6) MIN 3,6E+01 * 3,8E+01 * 1,0E+01 * 2,8E+01 * MAX 7,4E+02 1,3E+05 2,4E+06 1,6E+04 geom MEAN 2,0E+02 3,4E+03 4,8E+03 1,7E+03 range (geom mean±ds) 1,4E+01 7,8E+02 2,1E+01 4,3E+04 2,6E+01 6,4E+04 2,0E+01 1,5E+04 NoV results are considered as sum of GI and GII * estimated values (LOQ GI: copies/g; LOQ GII: copies/g) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA49

50 ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA OUTBREAKS Time NoV days copies/g batch ,2E+03 La Spezia batch ,9E+03 batch ,9E+03 batch ,3E+02 Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA50

51 Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA51

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