CROMATOGRAFIA Michail Semenovich Tswett (1872-1919), botanico russo, studioso dei pigmenti vegetali Miscela di idrocarburi Carbonato di calcio Esperimento fondamentale Fase 1: il campione viene caricato in testa alla colonna riempita di carbonato di calcio Fase 2: il campione viene eluito nella colonna finché i componenti escono separati 1 Cromatografia su colonna classica https://www.youtube.com/watch?v=iorrqbkb8lg 2
Cromatografia liquida a bassa pressione 3 Cromatografia preparativa 4
CROMATOGRAFIA Definizioni o fase mobile Fase stazionaria La cromatografia è una tecnica che permette di separare ed analizzare (sia per scopi qualitativi che quantitativi) miscele incognite liquide o gassose. Tutte le tecniche cromatografiche sono caratterizzate dalla presenza di una fase mobile che spinge gli analiti in avanti nel mezzo cromatografico, a velocità costante, e da una fase stazionaria che li rallenta in modo selettivo. Le due fasi devono essere tra loro immiscibili: la fase stazionaria può essere solida o liquida mentre la fase mobile può essere liquida o gassosa. La separazione dei componenti della miscela avviene a causa della diversa affinità che gli analiti hanno per le due fasi. 5 Classificazione delle tecniche cromatografiche 1. Stato fisico delle due fasi - cromatografia liquida - gascromatografia 2. Meccanismo di ritenzione - adsorbimento - ripartizione - scambio ionico - esclusione - affinità 3. Apparato strumentale - cromatografia su colonna - cromatografia su strato sottile 6
7 Adsorbimento La fase stazionaria è un solido. 8
La fase stazionaria è un liquido che ricopre un supporto solido. Ripartizione 9 Scambio ionico La fase stazionaria è un solido che presenta in superficie gruppi che portano una carica elettrostatica, positiva o negativa. 10
Scambio ionico Gli ioni del soluto competono con quelli della fase mobile per legarsi ai gruppi di carica opposta presenti sulla fase stazionaria. 11 Esclusione sterica La fase stazionaria è un solido o un gel che presenta dei pori di dimensioni note ed opportune. Le molecole più grosse non possono entrare nei pori e vengono eluite 12 prima di quelle più piccole.
Affinità La fase stazionaria è un solido derivatizzato in superficie con recettori in grado di legare solo la molecola in esame. 13 14
Cromatografia liquida a bassa pressione https://www.youtube.com/watch?v=lmiyhicwrfw (3 43 ) 15 Cromatografia liquida ad alte prestazioni HPLC: High Performance Liquid Chromatography 16
Cromatografia su strato sottile TLC: Thin Layer Chromatography 17 GC: Gascromatografia Forno R. Cozzi, P. Protti, T. Ruaro, Analisi Chimica Strumentale, 2 a edizione, Zanichelli,1997, volume C: Metodi cromatografici. 18
Il cromatogramma Il cromatogramma è il grafico del segnale fornito dal rivelatore in funzione del tempo di analisi. Il tempo zero è l istante dell iniezione del campione in colonna. Il cromatogramma è composto dalla linea di base (cioè il segnale della fase mobile in assenza di campione) e dai picchi cromatografici dovuti agli analiti che escono dalla colonna. t 0 19 Parametri cromatografici Ritenzione: è la capacità del sistema cromatografico di trattenere gli analiti presenti nel campione. Si ricava dalla posizione dei picchi nel cromatogramma. Selettività: è la capacità del sistema cromatografico di separare due analiti presenti nel campione. Si ricava dalla distanza dei picchi corrispondenti ai due analiti, nel cromatogramma. Efficienza: è la capacità del sistema cromatografico di eluire gli analiti come bande compatte (strette). Si ricava dalla larghezza dei picchi nel cromatogramma. 20
Ritenzione t R = tempo di ritenzione: tempo trascorso dall iniezione del campione all uscita del picco. t 0 = tempo morto: tempo trascorso dall iniezione del campione all uscita del solvente o di un soluto non trattenuto dalla fase stazionaria. È una misura del volume vuoto in colonna. k = fattore di capacità = (t R t 0 ) / t 0. t 0 21 Selettività È la capacità del sistema cromatografico di separare due analiti presenti nel campione. In GC ed HPLC si misura per mezzo del coefficiente di selettività α, definito come il rapporto dei relativi fattori di capacità: α = k B / k A Il coefficiente di selettività è una grandezza adimensionale ed è sempre maggiore o uguale a 1. 22
Efficienza È la capacità del sistema cromatografico di eluire gli analiti come bande strette. In GC e HPLC si può stimare misurando la larghezza dei picchi alla base (w) o a metà altezza (w ½ ), la deviazione standard del picco assimilato ad una gaussiana. t 0 23 Durante la corsa cromatografica le bande si allargano Quali sono meccanismi che provocano questo allargamento? 24
Efficienza Poiché la larghezza dei picchi dipende anche dal tempo di ritenzione una stima migliore dell efficienza si ha calcolando: N = 5.54 t 2 R / w 2 ½ N è adimensionale ed è detto: numero di piatti teorici. Volendo confrontare colonne di diversa lunghezza (L) si calcola l altezza equivalente di piatto teorico (H, HETP), che ha le dimensioni di una lunghezza (cm): H = L /N 25 A: Cammini multipli (se la colonna è impaccata) 26
B: Diffusione longitudinale 27 C: Trasferimento di massa 28
I meccanismi di allargamento di banda (e quindi l efficienza) dipendono dal flusso di fase mobile Equazione di van Deemter: H = A + B/v + Cv velocità di flusso, v 29 Risoluzione È la grandezza che misura l effettiva bontà della separazione, che dipende sia dalla selettività che dall efficienza del sistema. In GC ed in HPLC: R S = 1 2 t R 2 ( W t 1 dove t R sono i tempi di ritenzione dei due picchi e W sono le corrispondenti larghezze alla base. R s è adimensionale e il suo valore e maggiore o uguale a zero. R 1 + W 2 ) ΔtR = 2 W + W 1 2 30
La risoluzione dipende sia dalla selettività che dall efficienza 31 Asimmetria Raramente i picchi cromatografici sono perfettamente simmetrici: normalmente presentano una codatura verso i bassi tempi di ritenzione (fronting) o verso gli alti tempi di ritenzione (tailing). L asimmetria di un picco si misura attraverso il fattore di asimmetria: A s = b / a dove a e b sono le semilarghezze del picco, misurate a 1/10 dell altezza del picco. 32
Analisi quantitativa in cromatografia I metodi cromatografici possono anche essere usati per scopi quantitativi: l area del picco (e anche l altezza se il picco è simmetrico) è infatti proporzionale alla concentrazione dell analita. La concentrazione di un campione incognito si può ricavare per mezzo di diversi metodi di calibrazione. 33 Analisi quantitativa in cromatografia Curva di calibrazione Area del picco 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 Concentrazione 34
Cromatografia su strato sottile TLC: Thin Layer Chromatography 35 TLC: deposizione dei campioni sulla lastra 36
TLC: sviluppo della lastra 37 TLC: sviluppo della lastra 38
TLC: rivelazione 39 TLC: rivelazione 40
Ritenzione in TLC Fattore di ritenzione: R F = d i / d el 41 Risoluzione in TLC R s = d / ½ (w A + w B ) dove d è la distanza tra i centri delle due macchie A e B e w A, w B il loro diametro. 42
Cromatografia liquida ad alte prestazioni HPLC: High Performance Liquid Chromatography 43 Cromatografia liquida ad alte prestazioni HPLC: High Performance Liquid Chromatography 44
HPLC: iniezione Siringa per HPLC (100 μl) Valvola a 6 vie (Rheodyne) 45 Loop di iniezione HPLC: iniezione 3 4 5 3 4 5 2 1 6 2 1 6 LOAD INJECT 46
HPLC: colonna Particelle di silice sferica (5 μm) Colonna classica per HPLC (25 cm x 4.6 mm ID) 47 HPLC: rivelatori Rivelatore spettrofotometrico 1 Cella a flusso di tipo Z 48
HPLC: rivelatori Rivelatore spettrofotometrico a serie di diodi (Diode Array Detector, DAD) Spettrocromatogramma HPLC di una miscela di 5 componenti. La presentazione tridimensionale è consentita dall uso di un rivelatore UV/visibile in grado di acquisire immediatamente (in 60 ms) lo spettro durante l uscita di un picco. 49 Aflatossine estratte da un campione di mais per uso alimentare - HPLC Condizioni sperimentali Colonna: SUPELCOSIL LC-18, 25cm x 4.6mm ID, 5µm diametro delle particelle (con colonna di guardia) Fase mobile: metanolo:acetonitrile:acqua (22.5:22.5:55) Velocità di flusso: 1.5 ml/min Rivelatore: Visibile, 365nm Quantità iniettata: 100µL 50
Analisi di erbicidi - HPLC Condizioni sperimentali: Colonna: 20cm x 3mm ID, diametro particelle 5µm; silice ricoperta con polimero Fase Mobile : gradiente, A = acqua/0.05% H 3 PO 4, B = acetonitrile Temperatura: 50 C Velocità di flusso: 0.5mL/min Rivelatore: UV a serie di diodi, 210nm & 225nm Iniezione: 10µL of estratto 51 Determinazione di metalli di transizione nel siero - Cromatografia Ionica 52
GC: Gascromatografia Forno R. Cozzi, P. Protti, T. Ruaro, Analisi Chimica Strumentale, 2 a edizione, Zanichelli,1997, volume C: Metodi cromatografici. 53 GC: Gascromatografia 54
Setto di gomma Iniettore per colonne impaccate Siringa per iniezione 55 Colonna impaccata per GC: 1-6 m x 0.75-4 mm ID 56
Colonna capillare per GC: 15-100 m x 0.1-0.75 mm ID 57 La temperatura della colonna è uno dei parametri principali che governano la ritenzione. Esempio di profilo di temperatura a tre stadi (isoterma, rampa, isoterma) prima del ritorno alla temperatura iniziale per la nuova prova. Il forno a circolazione d aria calda deve permettere un accurato controllo della temperatura di esercizio (± 0.05 C) in un ampio intervallo (da ambiente a 400 C). Deve essere possibile variare la temperatura nel corso della prova (temperatura programmata) in modo rapido e preciso. 58
Effetto della temperatura sulla separazione di una miscela di idrocarburi alifatici lineari (da pentano a ottano, picchi 1-6), bromoformio (7), meta-clorotoluene (8) e metabromotoluene (9). 59 Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) Composti verso i quali il FID ha sensibilità bassa o nulla 60
Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) Caratteristiche del FID: Quasi universale e distruttivo. Tempi di risposta rapidi. Tra ugello (catodo, negativo) e collettore (anodo, positivo) viene applicata una ddp di circa 300 V. LOD: 10-9 10-12 g. Range lineare: 10 6 10 8 Adatto alla programmata. 61 Accoppiamento GC-spettrometro di massa (GC-MS) 62
Alcoli e derivati nel sangue per GC Condizioni sperimentali Impaccamento: 60/80 Carbopack B/5% Carbowax PEG 20M Colonna: 6m x 2mm ID vetro Temperatura: 85 C Gas vettore: elio, 20mL/min Rivelatore : FID (Ionizzazione di Fiamma) Iniezione: 1µL di soluzione acquosa 63 Esempio di applicazione del rivelatore FID Analisi di gasolio per autotrazione The GC-FID chromatogram for diesel fuel in a low level test run. (OI: original influent; BE: effluent from biofilter; TE: effluent from trickling filter.) Lei Yang, Ching-Ting Lai, Wen K. Shieh, Biodegradation of dispersed diesel fuel under high salinity conditions, Water Research, 34 (2000) 3303 3314. Column: Zebron ZB-1, GC Capillary Column. Dimensions:30 meters x 0.25 mm x 0.25 µm Stationary Phase:100% dimethyl polysiloxane. Carrier Gas: Constant Flow Hydrogen, 1.23 ml/min Oven Profile: 40 C (2 min) to 320 C @ 6 C/min Injection: Split 100:1 1 µl @ 250 C 64 Detection: Flame Ionization (FID) (325 C)
Esempio: analisi del caffè per GC Condizioni sperimentali Colonna: SUPELCOWAX 10, 30m x 0.25mm ID, 0.25µm film Temperatura: da 40 C (5 min) a 230 C (4 C/min) Rivelatore: Spettrometro di massa a trappola ionica Iniezione: splitless/split (tempo di chiusura 0.5 min), 270 C (0.75mm ID liner) 65 Considerazioni conclusive La cromatografia è una classe di tecniche molto versatili. Infatti: è applicabile a tutti i tipi di campione (eventualmente con un opportuno pretrattamento); permette di compiere l analisi senza una precedente separazione e/o purificazione; è utile sia per l analisi qualitativa che quantitativa; può essere impiegata a scopo preparativo. 66