Miglioramento del suolo e biostabilizzazione di metalli pesanti mediati da glomalina

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1 Migliormento del suolo e iostilizzzione di metlli pesnti mediti d glomlin Stefno Bedini, Elis Pellegrino, Emnuele Argese, Mnuel Giovnnetti * Diprtimento di Scienze Amientli, Università C Foscri, Clle Lrg Snt Mrt, Dorsoduro 2137, Venezi Diprtimento di Chimic e Biotecnologie Agrrie, Università di Pis, Vi del Borghetto 80, Pis Astrct L glomlin è un glicoprotein di recente scopert, prodott in grnde quntità di funghi micorrizici ruscolri (AM). Nei suoli, l quntità di glomlin è risultt essere correlt con i principli prmetri di fertilità. In questo lvoro viene vlutto il cmimento nei contenuti di glomlin e di ggregti stili ll'cqu (WSA 1-2mm ), in un terreno grrio dopo 4 mesi di coltur di Medicgo stiv micorrizt e non micorrizt. In considerzione dell ffinità dell glomlin verso il ferro, è stto inoltre nlizzto il contenuto in metlli del suolo e l percentule di questi legt ll protein. I risultti indicno un significtivo umento di glomlin e WSA nel terreno coltivto con le pinte micorrizte rispetto lle non micorrizte. Differenze sono stte nche riscontrte nell produzione di glomlin tr isolti diversi di due specie di AM: Glomus mossee e Glomus intrrdices. Tli evidenze confermno le potenzilità dei funghi AM nel migliormento di suoli compromessi o sottoposti d intenso regime gronomico ed indicno che l glomlin è in grdo di chelre fortemente non solo il ferro, m nche metlli pesnti potenzilmente tossici. L possiilità di selezione e successivo impiego di isolti di funghi AM d lt efficienz, in termini di produzione di glomlin, può rppresentre un utile strumento per il migliormento e il recupero di suoli compromessi e per l iostilizzzione di metlli pesnti in suoli contminti 2004 SItE. All rights reserved Keywords: micorrize; glomlin; ggregti; metlli; iostilizzzione; qulità del suolo 1. Introduzione I funghi micorrizici ruscolri (AM) vivono in ssocizione con le rdici di circ l 80% delle pinte terrestri. Orgnismi chive del sistem pint/suolo, tli funghi sono di fondmentle importnz per l fertilità del suolo e per l nutrizione dell pint. I funghi AM migliorno l struttur del suolo si indirettmente stimolndo e fvorendo lo sviluppo dell vegetzione (Giovnnetti & Avio, 2002) si direttmente grzie ll estes rete di ife extrrdicli che imriglino le prticelle di terreno e producono glomlin, un glicoprotein idrofoic contenente fino l 9% di ferro, prodott in grnde quntità di funghi AM (Wright et l., 1996). L glomlin stilizz gli ggregti del suolo e miglior l fertilità rllentndo l degrdzione dell sostnz orgnic e l perdit dei nutrienti ssociti (Miller & Jstrow, 2000; Rillig et l., 2001). In questo lvoro viene vlutto il cmimento nei contenuti di glomlin e * Corresponding uthor. Tel.: ; fx: ; e-mil: mgiov@gr.unipi.it.

2 2 Aville online t di ggregti stili ll cqu (WSA 1-2mm ), in un terreno grrio dopo 4 mesi di coltur di Medicgo stiv micorrizt e non micorrizt. In considerzione dell forte ffinità dell glomlin verso il ferro, è stto inoltre nlizzto il contenuto in metlli del suolo e determint l percentule di questi legt ll protein. I risultti ottenuti indicno un significtivo umento di glomlin e di ggregti stili ll cqu nel terreno coltivto con pinte micorrizte rispetto l terreno coltivto con pinte non micorrizte. Differenze sono stte nche riscontrte nell produzione di glomlin tr isolti diversi di due specie di AM: Glomus mossee e Glomus intrrdices. Tli evidenze confermno l potenzilità dei funghi AM nel migliormento di suoli compromessi o sottoposti d intenso regime gronomico ed indicno che l glomlin è in grdo di chelre fortemente non solo il ferro, m nche metlli pesnti potenzilmente tossici. L possiilità di selezione e successivo impiego di isolti di funghi AM d lt efficienz, in termini di migliormento dell qulità del suolo, può rppresentre un utile strumento per il migliormento e il recupero di suoli compromessi. 2. Mterili e metodi 2.1. Pint ospite e inoculi fungini I funghi AM utilizzti sono ceppi di divers origine geogrfic di due specie di Glomus (T. 1). Per ognuno dei ceppi fungini sono stti llestiti cinque vsi usndo come pint ospite Medicgo stiv L. cv. Messe. Come controllo sono stti preprti cinque vsi di er medic non micorrizt. L coltur è stt condott in serr con degute periodiche nnffiture e concimzioni. Il sustrto di crescit è stto preprto sterilizzndo un miscel 1:1 di suolo grrio (T. 2) e Terrgreen (clcined ttpulgite cly, Oil Dri UK Ltd.). Tell 1 Isolti fungini utilizzti nell esperimento Specie Ceppo Origine Geogrfic G. mossee IMA1 Kent, UK G. intrrdices IMA6 Digione, Frnci Inoculi forniti dll collezione IMA di Glomeromycot del Diprtimento di Chimic e Biotecnologie Agrrie dell Università di Pis. L inoculo micorrizico er costituito d inoculo grezzo proveniente dll collezione del Diprtimento di Chimic e Biotecnologie grrie dell Università di Pis. Unitmente ll inoculo micorrizico, tutti i vsi, compresi quelli di controllo sono stti somministrti 100 ml di estrtto filtrto di terreno grrio coltivto er medic in modo d ssicurre il ripristinrsi di un opportun microflor tteric Anlisi dell Glomlin L estrzione dell glomlin è stt effettut secondo l procedur descritt d Wright e Updhyy (1996). L glomlin totle (TG) è stt estrtt con citrto di sodio 50mM, ph C. L estrzione è stt effettut con più cicli di 60 min ciscuno. Il superntnte di ciscun ciclo di estrzione è stto rccolto in un unico pool e il contenuto in proteine è stto determinto medinte lettur spettrofotometric con il metodo Brdford usndo sierolumin ovin come stndrd Anlisi degli ggregti Mcro-ggregti di 1-2 mm di dimetro sono stti ottenuti medinte setccimento del sustrto disseccto ll ri. L stilità ll cqu degli ggregti è stt misurt medinte il metodo del wet-sieving effettuto con l pprecchitur e l procedur descritt d Kemper e Rosenu (1986): 20 g di ggregti sono stti gnti per cpillrità (12 h) e quindi sottoposti wet-sieving. Il peso secco inizile e finle degli ggregti sono stti corretti per il peso delle prticelle grossolne (>0.25 mm). L stilità degli ggregti del suolo è stt espress come percentule di mss del suolo ggregto risultnte dopo il wet-sieving rispetto ll mss totle del sustrto.

3 14 th Meeting of the Itlin Society of Ecology, 4-6 Octoer 2004, Sien Anlisi dei metlli L cpcità di sequestrre metlli potenzilmente tossici d prte dell glomlin è stt vlutt purificndo l protein estrtt ed ndndo verificre l quntità dei metlli presenti nell estr tto proteico così purificto. Gli estrtti proteici grezzi (TG) di tre cmpioni di terreno provenienti dl sustrto micorrizico sono stti purificti medinte precipitzione con cido triclorocetico e successiv dilisi in tmpone orto. Il contenuto totle di metlli pesnti nel terreno delle colture sperimentli è stto determinto eseguendo un minerlizzzione dei cmpioni medinte digestione con cqu regi e cido fluoridrico in digestore microonde (MDS ditt CEM) secondo l procedur mess punto d Argese et l., (2004). 0.1g di sustrto essiccto sono stti digeriti con un miscel di 5 ml di H 2 O, 3 ml di cqu regi, 1.5 ml di HF in contenitori di Teflon medinte digestore l 100 % di potenz, pressione 140 psi, tempertur 170 C per 60 min. Al termine dell digestione il cmpione è stto neutrlizzto con 5 ml di soluzione stur di cido orico sempre in digestore lle suddette condizioni. I cmpioni sono quindi stti portti 50 ml di volume con cqu Milli-Q. Gli stessi cmpioni di sustrto sono stti nlizzti per il contenuto di metllo non reticolre, cioè quell frzione di metllo che non fcendo prte del reticolo cristllino minerle può in teori rendersi disponiile per i processi iologici. In questo cso l estrz ione è stt effettut su cmpioni di 0.1 g con 1.9 ml di tmpone citrto 0.2 M ph 3 come estrente, sempre medinte digestore microonde l 90 % di potenz, 120 psi di pressione, 160 C di tempertur. L quntificzione dei metlli presenti nei cmpioni di sustrto è stt eseguit medinte spettrometri di ssorimento tomico (Spectr 250 Plus, ditt Vrin). I metlli nei cmpioni di protein sono stti, invece, determinti medinte ICP-MS (Eln 6100 Perkin-Elmer-Sciex) Anlisi sttistic L effetto de ll inoculo micorrizico sulle vriili misurte è stto testto sottoponendo i dti ll nlisi dell vrinz d un vi (ANOVA) e seprndo le medie medinte Tukey Post Hoc Test. Tell 2 Principli crtteristiche chimico-fisiche del terreno grrio utilizzto per l preprzione del sustrto di coltur Crtteristiche del suolo Tessitur Frnco-Sioso ph 8.0 Conduttività (ms) N tot. (g Kg -1 ) 1.3 P tot. (mg Kg -1 ) Mteri org. (g Kg -1 ) 22.4 metodi di nlisi pprovti dl Ministero delle Politiche Agricole e Forestli (MiPAF), pulicti sul supplemento ordinrio lle Gzzette Ufficili del e del Risultti e Discussione L oiettivo di questo studio è stto quello di verificre, in condizioni controllte, se i funghi AM ino un effetto migliortivo sull qulità del suolo in cui crescono. Aimo inoltre vlutto lcuni prmetri, come discriminnti tr isolti diversi di funghi AM, per l selezione di questi l fine di un futuro utilizzo iotecnologico per il migliormento e/o iorisnmento di terreni degrdti. I prmetri vlutti sono stti: ) l produzione di glomlin, protein che per le sue crtteristiche di ondnz, refrttrietà ll degrdzione, è un importnte frzione dell sostnz orgnic dei suoli nonché un sink del cronio tmosferico; ) l resistenz ll disgregzione degli ggregti di prticelle del terreno, uon prmetro di vlutzione dell strutturzione del suolo ed infine c) l potenzilità di iostilizzzione di elementi potenzilmente tossici quli i metlli pesnti opert di funghi AM ttrverso l glomlin d essi prodott Anlisi dell Glomlin Il suolo coltivto per quttro mesi con pinte di er medic micorrizte è risultto contenere glomlin in quntità decismente più lt rispetto l suolo non micorrizico (p<0.05). In presenz dei funghi AM il contenuto di glomlin ument fino ll 83 % rispetto i vlori inizili del suolo di origine (Fig. 1).

4 4 Aville online t Questi risultti indicno un chiro rpporto cuseffetto tr l presenz di funghi AM e l quntità di glomlin nel sustrto confermndo l ipotesi del ruolo centrle dei funghi AM sull produzione e sull ccumulo nei suoli dell protein (Wright & Updhyy, 1996; Rillig et l., 2001; Driver et l., 2004). m g/g suolo 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Nelle condizioni e nei tempi utilizzti nell prov, i diversi funghi AM si sono mostrti tutti efficienti produttori di glomlin con differenze, tr loro, sttisticmente non significtive (p>0.05). Benché quindi, si sino riscontrte differenze tr le due specie nell quntità di glomlin ccumult nel sustrto, l sol produzione di protein per i ceppi studiti e nelle condizioni utilizzte non è risultt rppresentre un deguto prmetro di selezione cpce di discriminre tr i diversi isolti fungini Anlisi degli Aggregti NM G. mos. G. int. Fig. 1. Contenuto di glomlin totle (TG) nei sustrti di coltur di M. stiv colonizzti d G. mossee (G. mos.) e G. intrrdices (G. int.) e nei controllo non micorrizti (NM). Gli istogrmmi mrcti con l stess letter indicno differenze tr i vlori sttisticmente non significtive per p> 0.05 Lo stto di ggregzione del sustrto di coltur è risultto vrire in ccordo con lo stto di micorrizzione delle pinte. L percentule di ggregti stili ll cqu nel sustrto di coltur in presenz dei funghi AM è risultt essere significtivmente più lt rispetto l suolo non micorrizico (p< 0.05) (Fig. 2). L struttur del suolo gioc un ruolo centrle nell funzionlità dei suoli e degli ecosistemi groforestli, controllndo i flussi e gli scmi di cqu, di gs e di nutrienti (Rillig et l., 2002). % Fig. 2. Percentule di ggregti stili ll cqu WSA 1-2mm nei sustrti di coltur di M. stiv colonizzti d G. mossee (G. mos.) e G. intrrdices (G. int.) e nei controllo non micorrizti (NM). Gli istogrmmi mrcti con lettere diverse indicno differenze tr i vlori sttisticmente significtive per p< 0.05 Il sensiile migliormento dello stto di ggregzione del sustrto, ottenuto dopo soli quttro mesi di coltur indic che i funghi AM sono in grdo di contriuire significtivmente e rpidmente ll strutturzione e quindi l migliormento dell qulità del suolo. Questo risultto concord con le ipotesi di un effetto ggregnte dei funghi AM dovuto l micelio extrrdicle (Miller & Jstrow, 2000) il qule, funzionndo come stringhe desive fvorisce l ggregzione delle prticelle del suolo; l glomlin, inoltre, prodott come costituente di prete, depositndosi nel terreno, per l su ntur idrofoic ument l coesione e l resistenz ll cqu delle prticelle g gregte. Tr le due specie nlizzte, G. intrrdices si è dimostrt essere cpce di migliorre mggiormente l stilità degli ggregti rispetto G. mossee (p<0.05) Anlisi dei Metlli NM G. mos. G. int. In considerzione dell presenz di ferro nell glomlin (Wright & Updhyy, 1998; Rillig et l., 2001), è stto verificto se l protein potesse legre e intergire nche con ltri metlli presenti nel terreno. Per questo motivo l termine dell prov l glomlin estrtt dl sustrto di coltur delle pinte micorrizte è stt purifict ed nlizzt per il contenuto in metlli. L procedur di estrzione in presenz di citrto, un forte chelnte di ioni metllici, e l successiv purificzione ssicurno l eliminzione del metllo eventulmente co -estrtto con l protein che non si fortemente legto d ess. c

5 14 th Meeting of the Itlin Society of Ecology, 4-6 Octoer 2004, Sien 5 I risultti ottenuti indicno che l glomlin leg fortemente molti dei metlli presenti nel suolo. Dopo estrzione e purificzione, un percentule cospicu dell frzione disponiile dei metlli risult essere fortemente legt ll protein. L percentule di metllo legt vri d metllo metllo. I vlori più lti sono stti trovti per Rme, Cromo e Nichel. Il 14 % del Rme disponiile, presente nel suolo, è risultto essere legto ll glomlin. Recentemente, González-Chávez et l., (2004) riportno nloghi risultti di ffinità tr metlli pesnti e glomlin di terreni contminti, confermndo l interzione tr l protein prodott di funghi AM e sostnze potenzilmente tossiche. L immoili zzzione di metlli nell glomlin, frzione proteic ltmente stile, può vere notevole significto non solo nei terreni grri dove elementi nutrizionlmente importnti quli ferro e rme possono in tl modo essere immgzzinti nel suolo e poi lentmente ceduti ll pint evitndo fenomeni di perdit per dilvmento; m possono vere un notevole interesse in terreni inquinti dove un eccesso di metlli può vere effetti tossici sull vegetzione e sui microrgnismi d ess ssociti. I risultti ottenuti in questo lvoro confermno che, nei suoli contminti, i funghi AM possono contriuire d llevire gli effetti tossicologici dei metlli grzie meccnismi di ioimmoilizzzione nei pool glomlinici. 4. Conclusioni Lo studio h evidenzito un spicct cpcità d prte dei funghi AM di migliorre l qulità del suolo nel qule crescono. I dti ottenuti indicno un significtivo umento del contenuto di glomlin e WSA 1-2mm nel terreno coltivto con pinte micorrizte rispetto l terreno non micorrizico. L nlisi del contenuto in metlli h messo in evidenz un sorprendente cpcità dell glomlin di immoilizzre quntità percentulmente importnti dei metlli iodisponiili presenti nel suolo. Queste osservzioni mettono in luce spetti positivi dell simiosi micorrizic nel sistem pint suolo che vnno oltre l spetto nutrizionle dei due simionti. Le proprietà evidenzite, il migliormento in termini di struttur e di contenuto di sostnz orgnic del suolo e l immoilizzzione di metlli, nche potenzilmente tossici, rendono i funghi AM soggetti di prticolre interesse nello sviluppo di strtegie di interventi per il iorisnmento di siti degrdti o contminti. Ringrzimenti Gli utori desiderno ringrzire il Dott. Polo Bzzoffi e il Sig. Andre Rocchini dell Istituto Sperimentle per lo Studio e l Difes del Suolo per i consigli e per l ssistenz nelle nlisi sullo stto di ggregzione del terreno e inoltre, il Dott. Sestino Bertini e l Sig.r Loren Goi del Diprtimento di Scienze Amientli Università C Foscri, per le nlisi dei metlli. Biliogrfi Argese, E., Bettiol, C., Cedolin, A., Bertini, S., Delney, E. (2003) Specition of hevy metls in sediments of the lgoon of Venice collected in the industril re. Annli di Chimic 93, Giovnnetti, M., Avio, L. (2002). Biotechnology of Arusculr Mycorrhizs. Applied Mycology nd Biotechnology Vol. 2. Agriculture nd Food Production (Eds. Khchtourins G. G. & Aror D. K.) pp Elsevier Science BV., Netherlnds. González-Chávez, M.C., Crrello-González, R., Wright, S.F., Nichols, K.A. (2004) The role of glomlin protein produced y rusculr mycorrhizl fungi in sequestering potentilly toxic elements. Environmentl Pollution 130, Miller, R.M., Jstrow, J.D., (2000) Mycorrhizl fungi influence soil structure. Arusculr Mycorrhizs: Physiology nd Function (ed. Kpulnik Y, Douds DD Jr), pp Kluwer Acdemic Pulishers, Netherlnds. Rillig, M.C., Wright, S.F., Eviner, V.T. (2002) The role of rusculr mycorrhizl fungi nd glomlin in soil ggregtion: compring effects of five plnt species. Plnt Soil 238, Rillig, M.C., Wright, S.F., Nichols, K.A., Schmidt, W.F., Torn, M.S. (2001) Lrge contriution of rusculr mycorrhizl fungi to soil cron pools in tropicl forest soils. Plnt Soil 233, Wright, S.F., Updhyy, A. (1996) Extrction of n undnt nd unusul protein from soil nd comprison with hyphl protein of rusculr mycorrhizl fungi. Soil Sci 161, 1-12 Wright, S.F., Updhyy, A. (1998) survy of soils for ggregte stility nd glomlin, glycoprotein produced y hyphe of rusculr mycorrhizl fungi. Plnt Soil 198,