I geni del metabolismo

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1 I geni del metabolismo Lezione 6 1

2 Premessa I Quello che interessa e individuare i geni che controllano le vie metaboliche. Per arrivare a questo risultato si possono usare diverse strategie (non tecniche: quelle sono sempre le stesse che vengono scelte dopo aver deciso le strategie) che dipendono dalle informazioni che si hanno a disposizione. Quindi di volta in volta possono cambiare. Esistono pero dei punti fermi sempre validi non necessariamente in questo ordine: devono esistere fenotipi alternativi che permettano di suddividere la popolazione in almeno 2 gruppi per poter capire le modalita di trasmissione, definire il numero dei locus bisogna raccogliere informazioni il piu dettagliate possibili sulla funzione per avvicinarsi il piu possibile al prodotto primario del gene 2

3 Premessa II E pertanto dato che per capire come si svolge una funzione e quale sequenza di DNA la controlla bisogna vedere cosa succede se la funzione viene meno e nell uomo in cui non si puo fare l uomo knock out si ricorre alle patologie. Infatti posso sapere come viene sintetizzato un certo composto, in quale tessuto, in quale tipo cellulare, ma dato che le vie metaboliche non sono lineari e i fattori che intervengono per ottenere il prodotto finale sono molteplici risalire al gene puo essere molto complicato Quindi le patologie di cui parleremo sono i nostri mutanti knockout che ci servono per trovare il gene normale. L albinismo oculocutaneo e solo un modello per spiegare una strategia per lo studio a partire da processi in parte noti controllati da geni la cui manifestazione si trasmette come carattere recessivo 3

4 Entrambi i sessi presentano il fenotipo Aumentata incidenza della consanguineita I genitori sono eterozigoti w/m Gli individui che presentano il fenotipo di solito sono figli di soggetti che non presentano il fenotipo Autosomica recessiva aa Aa A- Aa Aa aa??? A- A- A- Aa individui con un fratello o sorella con il carattere hanno 2/3 di probabilita di essere portatori dell allele mutato.?? Aa Aa aa aa A- A-? aa aa A- aa Ciascun figlio successivo a quello che presenta il carattere ha il 25% di probabilita di mostrarlo (I legge di Mendel) questa e la conclusione a cui si arriva studiando tutte le famiglie in cui sia presente un affetto, quando inizio a studiare non so quale sia la trasmissione. Dall analisi degli incroci ricavo che il fenotipo si tramette con alcune caratteristiche che lo fanno classificare come autosomico recessivo, quindi l affetto e omozigote m/m 4

5 La storia Nel 1908 Sir Archibald Garrod noto che alcune malattie ricorrevano nelle famiglie. Le nozioni di biochimica erano ancora limitate e si ignoravano del tutto le relazioni biochimiche con l eredita. Tuttavia egli ipotizzo che la malattia fosse legata ad un blocco ereditario di un percorso biochimico essenziale. Egli descrisse due difetti del metabolismo della tirosina : albinismo e alcaptonuria.descrisse inoltre la cistinuria e la pentosuria Egli parti dall osservazione che alcuni soggetti con artrite degenerativa presentavano urine che scurivano se esposte all aria, palato pigmentato Egli noto anche che se a questi pazienti veniva somministrato acido omogentisinico, questo veniva escreto in grosse quantita nelle urine. La stessa escrezione aumentata sia ritrovava se i pazienti avevano una dieta ricca di proteine e soprattutto se nella dieta c erano tirosina e fenilalanina, cosa che non si verifica in persone normali 5

6 La storia II Garrod interpreto queste osservazioni ipotizzando che l acido omogentisinico fosse un normale prodotto del metabolismo della fenilalanina e della tirosina, che normalmente non viene escreto perche trasformato in altri metaboliti. Negli alcaptonurici questa trasformazione non puo aver luogo e percio viene accumulato in alcuni tessuti ed escreto nelle urine. Egli espresse il concetto di via metabolica come insieme di passaggi mediati da enzimi (Garrod AE: The Croonian lectures on inborn errors of metabolism.lancet 2 :1-7;73-79; ; ,1908 ): Il concetto di metabolismo come un blocco sta cedendo il passo alla visione di metabolismo come comparti. L idea che sta emergendo e che ci sono passaggi (step) successivi nel costruire e nel distruggere particolari molecole proteiche e zuccheri ad opera di fermenti speciali che vengono utilizzati per scopi definiti 6

7 La storia III Garrod sottolineo inoltre la presenza della familiarita (Cfr. Lancet ): Queste anormalita si verificano in piu fratelli e sorelle i cui genitori non manifestano nessun tipo di anomalia. Inoltre la trasmissione diretta da genitore a figli e estremamente rara In 8 delle 17 famiglie da lui studiate i genitori erano cugini primi: Bateson (biologo inglese che conio il termine genetica) a cui Garrod si rivolse per sapere se questa informazione potesse avere rilevanza, interpreto il dato alla luce delle neo riscoperte leggi di Mendel. Egli comprese che il matrimonio fra cugini primi crea le condizioni per rendere piu probabile la comparsa di caratteri recessivi rari. La conseguenza di queste osservazioni era che l allele normale fosse in qualche modo necessario per la produzione di uno specifico enzima. Era il primo indizio che i geni codificano per gli enzimi 7

8 La storia IV Garrod intui il concetto di individualita biochimica e genetica (Cfr. Lancet ): L esistenza dell individualita chimica segue necessariamente dalla specificita chimica. Anche quelle incompatibilita nei confronti di medicine ed alimenti che sono riportate nel detto che dice che il cibo di un uomo puo essere il veleno di un altro, hanno presumibilmente una base chimica (e genetica). Garrod fu quindi un profeta anche della farmacogenetica e intui il concetto di suscettibilita genetica come background su cui agiscono gli agenti esogeni. Come tutti i profeti non fu molto seguito all epoca: le sue intuizioni erano troppo innovative per i sui tempi. Bisogno aspettere quasi 40 anni (una generazione!) perche le sue idee trovassero conferma. 8

9 La storia V Negli anni 40 grazie agli sperimenti di Beadle e Tatum su Neurospora si dimostro che i singoli step metabolici sono controllati da singoli enzimi e singole mutazioni alterano singole funzioni. Venne formulata l ipotesi un gene, un enzima che prevede che per ogni proteina enzimatica esista un locus e che i percorsi metabolici siano una catena reazioni dovute all azione di piu enzimi. Beadle e Tatum non partirono dalle osservazioni di Garrod quando fecero i loro esperimenti, dal momento che all epoca ignoravano le sue osservazioni,ma nel 1958 quando ricevettero il Nobel, Beadle nel suo discorso di accettazione riconobbe il contributo di Garrod: Noi abbiamo dimostrato cio che Garrod aveva visto chiaramente parecchi anni prima. Venimmo a conoscenza del suo lavoro e fummo consapevoli che avevamo aggiunto poco o niente alla teoria. 9

10 Difetti congeniti del metabolismo I I difetti congeniti del metabolismo sono ereditati con modalita recessiva. Perche? Una via metabolica e un percorso complesso articolato in piu reazioni catalizzate da enzimi. Gli enzimi sono molecole proteiche in grado di espletare la loro funzione in piccole quantita e non si consumano nel corso della reazione. Di solito le quantita sintetizzate di enzima sono in eccesso rispetto alle necessita della reazione. 10

11 Un gene- un enzima La teoria di Beadle e Tatum prevede che l assenza di un enzima porti oltre che al blocco del percorso metabolico,anche l accumulo delle sostanze a monte del blocco e la mancanza dei prodotti a valle Geni funzionanti gene A gene B gene C gene D enzima substrato A a B enzima b C enzima c D enzima d prodotto finale E Un gene mutato* substrato A a B gene A gene B gene c* gene D enzima enzima b accumulo di A,B,C enzima C D d assenza di D ed E prodotto finale E 11

12 pero la situazione e piu complessa l assenza di un prodotto non e legata solo alla mancanza dell enzima: possono mancare tutte quelle molecole che concorrono alla buona riuscita di una reazione: cofattori, ligandi per il trasporto attraverso le membrane, fattori di trascrizione,... quindi oggi noi sappiamo che non basta verificare l assenza o l accumulo di un prodotto per correrarla con l assenza dell enzima quello che possiamo dire e che quella via metabolica e alterata 12

13 Messaggio Un difetto genetico del metabolismo non e originato solo da alterazioni del gene codificante l enzima coinvolto nella singola reazione, ma puo essere originato dalla mutazione del gene del coenzima, dalla mancata produzione dei carrier di specifiche molecole (malattie lisosomiali)(cfr testo) 13

14 LOCUS A Perche recessivi Genotipo Enzima Substrato + enzima prodotto + enzima AA Aa aa 14

15 Da dove si incomincia? I L albinismo oculocutaneo e solo un modello per spiegare una strategia per lo studio a partire da processi in parte noti controllati da geni la cui manifestazione si trasmette come carattere recessivo Il colore della pelle e un carattere legato all espressione di svariati geni, ma se utilizziamoil criterio (ricordate che la scelta del criterio e arbitraria ed e decisa dall operatore): assenza di qualsiasi colore cioe pelle chiarissima, capelli chiari, iridi depigmentate, sensibilita alla luce in poche parole assenza di melanina, vediamo che questa caratteristica fenotipica e presente in tutti gli organismi che hanno una qualche pigmentazione. Ci sono individui depigmentati in tutte le specie animali e in tutte le popolazioni umane, quale che sia il loro colore piu diffuso. 15

16 Da dove si incomincia? II Possiamo percio suddividere la popolazione in due gruppi: pigmentati e non. Se sto studiando i topi o altri organismi a riproduzione rapida e che posso incrociare, programmo gli incroci appropriati, reincroci (Genetica I). Nell uomo non posso farlo allora utilizzo gli incroci spontanei: analizzo le famiglie Perche faccio questo studio? che informazioni ne ricavero? a che mi serviranno? So gia in partenza che il mio fenotipo e a questo stadio troppo generico:il colore della pelle non e verosimilmente dovuto alla variazione di un singolo gene e non potendo studiarli tutti insieme devo cercare di scorporare i sottoinsiemi che costituiscono l insieme dei non pigmentati. 16

17 Da dove si incomincia? III L analisi delle famiglie mi permette di definire le modalita di trasmissione se autosomico o Xlinked, se dominante o recessivo. Da questo primo screening vedo che come atteso (perche?) il fenotipo e recessivo e che esistono locus X linked e autosomici e che percio e presente eterogeneita di locus quindi come vado avanti? ho informazioni sul pigmento: la melanina? La melanina non si introduce come tale, si costruisce attraverso un processo metabolico complesso (me lo dice il biochimico) Viene prodotta da cellule specializzate: i melanociti (me lo dice il citologo e il fisiologo cellulare) Adesso mi domando: la melanina non c e perche non si forma o perche non ci sono le cellule che la producono? 17

18 Come vado avanti? I Viene prodotta da cellule specializzate: i melanociti (me lo dice il citologo e il fisiologo cellulare) So distinguere senza possibilita di errore i melanociti? se si, posso utilizzare questo test per dividere all interno dei non pigmentati quelli che sono tali perche mancano i melanociti. Allora divido il mio insieme di non pigmentati in due sottoinsiemi: quelli con un numero normale e quelli che ne sono privi. Per quello che riguarda l albinismo si concentrarono sull insieme con melanociti normali, perche? 18

19 Come vado avanti? II Perche avevano la possibilita di suddividere ulteriormente il sottoinsieme e non dovevano impelagarsi nella ricerca di geni dello sviluppo e/o del differenziamento infatti: La biochimica conosceva le tappe del ciclo di sintesi della melanina e aveva la possibilita di dosare gli enzimi, e di suddividere in diversi gruppi gli affetti: il fenotipo da seguire non e piu depigmentazione, ma assenza dell enzima A (fenotipoa), assenza dell enzima B (fenotipo B)., e molto piu accurato e mi permette di evidenziare altri sottoinsiemi. Pero non e detto che la mancanza di un enzima sia dovuta alla mutazione del gene che codifica per l enzima. 19

20 Come vado avanti? III Si concentrarono sulla tirosinasi che catalizza il primo step e che era possibile estrarre dai melanociti cosa che li metteva in condizione di poter programmare strategie di clonaggio. Un gruppo di albini con melanociti normali mostrava assenza di tirosinasi quindi si puo supporre che condividendo lo stesso fenotipo biochimico condividano le mutazioni nella stessa regione, non la stessa mutazione.(cosa vuol dire?) Quando parliamo di mutazione del DNA con effetto patogeno i punti in cui una variazione puo compromettere la funzione possono essere piu di uno. Il fenotipo finale: assenza della funzione e sempre lo stesso. L allelia multipla riguarda sia le mutazioni patogene che i polimorfismi 20

21 Albinismo oculocutaneo OCA L albinismo oculocutaneo OCA e caratterizzato da: assenza di pigmentazione dovuta all incapacita di sintetizzare la melanina, mentre il numero dei melanociti e normale. La melanina e presente nei capelli, nella cute e nella retina. la patologia ha frequenza 1/ nella popolazione caucasica e 1/ nella popolazione africana. La via che porta alla sintesi della melanina parte dall amminoacido tirosina, che e coinvolto in una serie di altre reazioni il cui mancato svolgimento porta alla manifestazione di altri difetti congeniti del metabolismo: Alcaptonuria e Fenilchetonuria (ricordate che le vie metaboliche non sono rette, ma cespugli) 21

22 La tirosinasi Le prime due tappe che portano alla sintesi della melanina sono catalizzate dalla tirosinasi che in una prima reazione idrossila la tirosina e successivamente catalizza l ossidazione della diidrossifenilalanina ottenuta, in DOPA-chinone. Il gene della tirosinasi e stato clonato e sono state identificate le mutazioni che sono la causa della comparsa dell albinismo oculo cutaneo Le strategie di clonaggio sono varie: lo scopo e quello di identificare la sequenza di DNA voluta in mezzo a tutte quelle che si possono isolare 22

23 La tirosinasi clonaggio Dal momento che si conoscevano le basi biochimiche della patologia e stato possibile utilizzare il clonaggio funzionale Non si conosceva la sequenza della tirosinasi, ma si sapeva che era coinvolta, pertanto si sintetizzo il cdna a partire da RNA totale estratto da cellule che sintetizzano l enzima e si inserirono i cdna in fagi. Creazione di una library di cdna in vettore di espressione Produzione di anticorpi specifici per la tirosina Screening della library di espressione e isolamento della colonia Ricerca nei topi del DNA corrispondente al cdna clonato Sequenza dei cdna cercando una ORF Screening di una library di DNA genomico per isolare la sequenza completa Analisi del DNA degli affetti per individuare le mutazioni 23

24 Analisi delle mutazioni di OCA I Il gene della tirosinasi e lungo circa 50Kb ed e composto da 5 esoni La ricerca delle mutazioni e essenziale per definire se il gene clonato e quello che una volta mutato provoca la patologia in esame Infatti so solo che quella e la sequenza di DNA che codifica per la tirosinasi, che so mancare in un gruppo di albini: ma l assenza di un enzima non e detto che sia dovuta sempre a mutazioni nella sequenza che definisco gene dell enzima X. Potrebbe essere dovuta all assenza del suo fattore di trascrizione,il suo cofattore se ce l ha o di altre molecole che garantiscono la sua maturazione post traduzionale, o il suo trasporto al di fuori della cellula devo confrontare la sequenza clonata con la corrispondente sequenza nei miei affetti, attenzione non solo la sequenza codificante.. 24

25 Analisi delle mutazioni di OCA I Bisogna tenere presente che le variazioni di sequenza non sempre sono patogene, possono anche rappresentare polimorfismi che nel caso delle recessive costituiscono un problema. Perche? Sono ancora nella fase di ricerca non nella diagnostica. Nella popolazione generale e impossibile definire se un soggetto e portatore o meno dell allele patogeno.bisogna sempre esaminare gli affetti e i loro genitori, anche i fratelli possono essere fonte di errore: potrebbero essere non portatori 25

26 Analisi delle mutazioni di OCA II Nell albinismo oculocutaneo grazie al sequenziamento del gene e stata evidenziata la presenza di mutazioni diverse in siti diversi del gene (allelia multipla), che possono provocare fenotipi leggermente diversi. Non confondere questo con l eterogeneita genetica che e pure presente nell albinismo. Esistono altre forme di albinismo non legate a mutazione del gene della tirosinasi, che dipendono da mutazioni di altri loci 26

27 Analisi delle mutazioni di OCA III Come si studiano le famiglie per riuscire ad assegnare una specifica sequenza ad una malattia? Bisogna sempre analizzare i risultati nel loro insieme, utilizzando le informazioni che vengono dalla popolazione generale. Prima ricordiamo alcune definizioni 27

28 Le mutazioni Il tasso di mutazione del DNA codificante risulta piu basso rispetto al non codificante in quanto la pressione selettiva agisce eliminando dalla popolazione gli alleli negativi e rendendo di fatto assenti nella popolazione quelle mutazioni che alterino pesantemente la funzione del prodotto genico 28

29 Le mutazioni Va ricordato che le mutazioni avvengono a caso percio sia il DNA codificante che il non codificante sono egualmente suscettibili. Le conseguenze sono ovviamente diverse. Le conseguenze nella parte codificante (che costituisce circa il 3% del genoma umano) sono legate al tipo di mutazione: mutazioni silenti (sinonime) mutazioni non sinonime Le mutazioni sinonime vengono considerate neutre, mentre le non sinonime vengono suddivise in tre classi a seconda dell effetto che producono: senza effetto con effetto deleterio forniscono un vantaggio selettivo 29

30 Le mutazioni Sostituzione silente: non determina alcun cambiamento nel prodotto: l amminoacido resta lo stesso. Dal momento che modifica la sequenza puo originare un RFLP. In qualche caso puo dare origine ad un sito di splicing criptico e quindi essere tutt altro che neutre come la semplice sequenza potrebbe far pensare. Sostituzione non senso: si origina un codone di stop. Dal momento che la pressione selettiva e forte su un prodotto troncato prematuramente, nella popolazione sono rare nella sequenza codificante. 30

31 Le mutazioni Sostituzione di senso errato:si origina un codone per un altro amminoacido conservativa : il nuovo amminoacido ha caratteristiche chimiche simili al vecchio.pertanto l effetto sul prodotto puo essere minimo e puo essere definito polimorfismo sia a livello di DNA che di prodotto non conservativa: il nuovo amminoacido e completamente diverso dal vecchio. Puo avere effetti deleteri. conservativa rispetto a che? 31

32 Analisi delle mutazioni di OCA IV Presenza di piu una mutazione nel DNA dell affetto: La stessa sostituzione e presente nella popolazione generale anche in omozigosi senza conseguenze? se si e un polimorfismo e ci dice che quella regione della proteina o quell amminoacido non e critico per la funzione. E una mutazione conservativa ai fini della funzione.(l accumularsi di dati su piu famiglie e sulla popolazione generale facilita l interpretazione) 32

33 Analisi delle mutazioni di OCA VI Ognuna delle altre mutazioni e presente in omozigosi in altri soggetti albini non imparentati? Se si e probabile che siano patogenetiche e ritrovarne una nei fratelli dell affetto lo fa identificare come portatore (la mutazione deve essere presente in eterozigosi in un genitore) Ognuna delle altre mutazioni e presente in omozigosi in altri soggetti albini non imparentati? Se no riguarda una regione nota per essere necessaria al funzionamento della proteina? Se si e probabile che sia patogenetica (cfr. sopra) 33

34 Analisi delle mutazioni di OCA VI Nell albinismo oculocutaneo sono stati trovati eterozigoti composti: soggetti affetti in cui la mutazione patogeneticanon e presente in omozigosi, ma la presenza di due alleli patologici fa manifestare la malattia. I genitori ed eventuali fratelli in cui e presente anche l allele wild-type sono eterozigoti per una sola mutazione. 34

35 Mappa delle mutazioni di OCA I II III IV V Cu(A) Cu(B) Mutazioni puntiformi: patogene Mutazioni puntiformi:polimorfismi Mutazioni frameshift 35

36 Diagnostica quanto diremo vale per la diagnostica delle malattie ereditarie: le tecniche sono le stesse per tutte, si scelgono quelle piu appropriate a seconda dei casi. Cominciamo dalla termiologia analisi genetica L analisi individua il genotipo di individui a rischio per ben definite patologie. Oggi possono essere identificate anche prima della nascita piu di 300 malattie genetiche. La maggior parte sono rare e l analisi viene fatta solo quando c e una indicazione precisa 36

37 Diagnostica: screening Lo screening genetico si effettua su una popolazione o su un gruppo di individui non imparentati. Non si possono fare screening per tutte le possibili malattie: si effettua su una popolazione in cui una particolare patologia ha un incidenza significativa: es.tay-sachs nei canadesi francofoni o negli ebrei orientali. L anemia falciforme nel bacino mediterraneo, la talassemia... 37

38 screening un test di screening deve rispondere ad alcune caratteristiche: La popolazione da testare e ben identificata L analisi e economica e rapida L analisi prenatale consente alle coppie di portatori di operare scelte riproduttive. E possibile anche nel caso degli affetti intervenire per impedire la comparsa della patologia: fenilchetonuria 38

39 Diagnostica Finora abbiamo visto come si affronta lo studio di un gene del metabolismo a partire da una funzione di cui in parte e noto il meccanismo. Si e clonato il gene, adesso si possono trasferire nella pratica di laboratorio le informazioni raccolte E presente eterogeneita genetica? Se si siamo certi della diagnosi? Quale e il modello di trasmissione? Esistono poche o molte mutazioni patogene? E presente un effetto del fondatore? Il malato e ancora vivente? e perche viene richiesta la diagnosi? Queste domande sono valide per qualunque malattia genetica indipendentemente dal modello di trasmissione! 39

40 esempio con OCA E presente eterogeneita genetica? Se si siamo certi della diagnosi? Il fenotipo e il risultato di una catena di interazioni:il risultato finale puo risultare simile anche quando i locus sono diversi. Nel caso dell albinismo esistono piu loci la cui mutazione provoca la mancata pigmentazione. Inoltre altre patologie complesse presentano fra le altre manifestazioni cliniche la depigmentazione. Il termine albino e troppo generico Per esempio esiste l albinismo oculare OA che ha eredita X-linked in cui la cute e le articolazioni non sono coinvolti, e in una sua forma si accompagna a sordita 40

41 esempio con OCA E presente eterogeneita genetica? Se si siamo certi della diagnosi? Nel caso di OCA, ne esistono almeno tre tipi: Tipo I,OCA1: originato dalla mutazione del gene della tirosinasi, mappa in 11q.All interno di questo tipo sono stati descritti almeno 3 sottotipi: Tipo I, OCA1A: Albinismo oculocutaneo classico con assenza totale di attivita tirosinasica Tipo I, OCA1B: Albinismo oculocutaneo con attivita parziale della tirosinasi. Viene anche definito mutante giallo in quanto il colore dei capelli e piu vicino al biondo che al bianco. Una variante di questo e l albinismo sensibile alla temperatura indicato come OCA1-TS legato ad una missenso che provoca una ridotta stabilita alle temperature corporee 41

42 esempio con OCA E presente eterogeneita genetica? Se si siamo certi della diagnosi? TipoII OCA2: Questo tipo presenta attivita tirosinasica e mappa in 15q. E dovuto alla mutazione del locus p, spesso si ritrova associato alla sindrome di Prader-Willi dovuta a delezione di una grossa regione cromosomica TipoIII, OCA3: E dovuto alla mutazione del gene TYRP1:(tyrosinase-related-protein-1) che si ritiene abbia un ruoloregolatorio nell attivita della tirosinasi.mappa in 9q 42

43 esempio con OCA Quale e il modello di trasmissione? Autosomico recessivo Mutazioni puntiformi: patogene Esistono poche o molte mutazioni patogene? Mutazioni puntiformi:polimorfismi Mutazioni frameshift I II III IV V Cu(A) Cu(B) Le mutazioni presenti sono diverse all interno della popolazione generale, ma sono concentrate in punti particolari della molecola: esone I e III, indicando che queste regioni sono critiche per l attivita dell enzima 43

44 esempio con OCA E presente un effetto del fondatore? SI Alcuni tipi di mutazioni sono piu rare di altre e si ritrovano solo in alcuni gruppi etnici,in cui possono essere presenti in omozigosi, indicando che hanno avuto un ancestore comune in cui si e originata la mutazione OCA1B e OCA1-TS: sono un esempio di effetto del fondatore: infatti il primo e stato descritto in un gruppo Amish (comunita religiosa isolata geneticamente per motivi religiosi) in cui era presente in omozigosi una mutazione missenso(cfr.testo). 44

45 esempio con OCA Il malato e ancora vivente? e perche viene richiesta la diagnosi? La presenza del malato rende piu facile definire quali delle n possibili mutazioni sono presenti nella famiglia e quindi identificare lo stato di portatore di altri membri della famiglia o eseguire una diagnosi prenatale Utilizzando la PCR per amplificare i due esoni in cui si concentrano le mutazioni e sequenziando il prodotto di amplificazione, si individuano gli alleli mutanti presenti nell affetto. Una volta individuate quale sia la sequenza mutata la diagnosi all interno della famiglia si puo fare con gli ASO (cfr.testo) Nel testo troverete alcuni esempi di diagnostica che si riferiscono anche ad altri difetti del metabolismo. 45

46 Il materiale didattico e presente in rete: NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul libro 46