Le biotecnologie Definizione Classificazione Biotecnologie tradizionali respirazione fermentazione ossidoriduzioni

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1 Le bioecnologie Definizione Per bioecnologie si inendono quei processi indusriali che sfruano la capacià di paricolari sisemi biologici (microrganismi viveni o semplici enzimi) di produrre sosanze di ineresse commerciale. Tra le numerose definizioni relaive a ale ermine una delle più perineni recia: le bioecnologie sono l insieme delle ecniche che consenono di uilizzare organismi viveni (baeri, lievii, cellule vegeali e/o animali) o pari di essi (enzimi, acidi nucleici) per la produzione di sosanze uili all uomo, o per il migliorameno delle caraerisiche di animali e/o piane Classificazione Le bioecnologie si disinguono uleriormene in: Bioecnologie radizionali Bioecnologie innovaive o avanzae Fanno pare del primo ramo ui quei processi nei quali, uilizzando microrganismi o pari di essi, si producono sosanze uili all uomo, in paricolare alimeni e bevande fermenae. Le Bioecnologie innovaive nascono dall inegrazione di mole discipline (Biologia, Medicina, Ingegneria, Chimica) ed hanno le maggiori applicazioni in seori quali Farmacologia, Medicina, Agricolura, Zooecnia, Veerinaria, Ambiene. La branca più innovaiva e rivoluzionaria delle bioecnologie avanzae è l Ingegneria geneica. Bioecnologie radizionali Tui i processi fermenaivi (così chiamai perché la maggior pare di quese rasformazioni avviene con sviluppo di gas) sono perano processi bioecnologici. Lo sfruameno indusriale delle fermenazioni ha inizio nei primi decenni del XX secolo (eanolo, aceone, glicerina, buanolo, acido cirico). Dopo la II a guerra mondiale le produzioni bioenologiche hanno ineressao principalmene la fabbricazione di anibioici (prima ra ui la penicillina) e, successivamene, seroidi, alcaloidi, e amminoacidi. I microrganismi, come gli alri esseri viveni, hanno bisogno di energia per riprodursi e per svolgere ue le alre funzioni viali. Salvo rare eccezioni l unica fone di energia è quella fornia da demolizioni ossidoriduive di composi organici. Si ha la respirazione quando la demolizione è complea: uo il carbonio presene nei composi di parenza è rasformao in CO 2. Si ha la fermenazione quando la degradazione non è complea: olre all evenuale CO 2 si formano svariai composi, la cui sruura può essere più o meno semplice delle sosanze di parenza. Se ali processi avvengono in presenza di O 2 vengono definii aerobi, alrimeni sono anaerobi. A parià di sosanza degradaa, la respirazione fornisce una quanià di energia neamene maggiore rispeo alla fermenazione: C 6 H 12 O 6 6CO 2 + 6H 2 O kj C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2CO kj ei processi fermenaivi si formano numerosi prodoi inermedi di noevole imporanza (che sanno alla base del loro sfruameno indusriale). I prodoi oenui sono diversi a seconda dei subsrai fermenai, della specie di microrganismi impiegai e delle condizioni di reazione. La respirazione e la fermenazione non sono processi semplici, in enrambi i casi alcune delle reazioni che li compongono sono ossidoriduzioni. ella respirazione si ha una complea ossidazione dei composi organici di parenza sino a CO 2 ed H 2 O; queso può avvenire in aerobiosi ed anaerobiosi. el secondo caso l ossidane, anziché ossigeno molecolare, è cosiuio da diverse specie inorganiche quali nirai o solfai oppure la sessa anidride carbonica prodoa dalla respirazione. elle comuni fermenazioni (anaerobie) il subsrao organico iniziale viene meabolizzao in prodoi organici, alcuni dei quali sono più ossidai ed alri più ridoi di quelli di parenza. ella maggior pare delle fermenazioni l ossidane è un composo organico (anaerobiosi); solo in alcuni casi (fermenazione aceica e cirica) l ossidane è cosiuio da O 2 (aerobiosi). I processi fermenaivi indusriali hanno diverse applicazioni: 1. Crescia microbica l obieivo è la produzione di microrganismi che possono essere usai al quali (per fornire proeine per l alimenazione del besiame) oppure usai per produrre ceppi selezionai (geneicamene sabili, privi di alre specie, conservabili, riproducibili in empi brevi e in condizioni sandardizzae). 2. Produzione di meabolici l obieivo è la produzione di sosanze da pare dei microrganismi. Il meabolismo cellulare è cosiuio da una vasissima serie di reazioni concaenae. Qualunque composo formao durane quese reazioni è un meabolia. I composi essenziali alla via dei microrganismi sono dei meabolii primari (es.: amminoacidi, nucleoidi, acidi organici, viamine, alcoli). I composi non essenziali alla via microbica sono dei meabolii secondari (aniumorali, anibioici, inseicidi, faori di crescia). I meabolii primari vengono prodoi durane il normale processo di crescia, quelli secondari vengono prodoi nella fase sazionaria quando la crescia miscrobica è erminaa. 3. Depurazione biologica 1

2 l obieivo è lo sfruameno dell aivià svola dai microrganismi. I fenomeni biologici sono alla base dei processi depuraivi uilizzai per le acque di scarico che conengono sosanze organiche biodegradabili. I microrganismi impiegai non sono singole specie baeriche o pochi ceppi selezionai, ma un insieme eerogeneo di decine, se non ceninaia di specie cosiuie da baeri, funghi, proozoi mono e pluricellulari. I processi impiegai nel raameno delle acque reflue sono principalmene di ipo aerobio: i microrganismi, uilizzando l ossigeno, rasformano le sosanze organiche in CO 2 ed H 2 O. L azoo, lo zolfo ed il fosforo evenualmene preseni sono rasformai nei rispeivi composi ossigenai (O 3 -, SO 4 2-, PO 4 3- ). I processi bioecnologici possono essere disini in re caegorie anche in base alle segueni caraerisiche: 1. ella prima vi è una srea relazione fra il consumo di composo uilizzao come fone di energia, la formazione del prodoo e la crescia del microrganismo (fermenazione alcolica: il consumo di glucosio procede di pari passo con la formazione di alcol eilico e di biossido di carbonio). 2. ella seconda il prodoo è un inermedio del processo di demolizione del composo uilizzao come fone di energia, esso si accumula poiché le condizioni di reazione sono apposiamene modificae per ale scopo (sinesi dell acido cirico con condizioni operaive quali: bassi valori di ph (2-3), emperaura fra C, assenza di ioni Fe 2+, basse concenrazioni di sosanze azoae e di fosfai). 3. ella erza non esise alcuna relazione fra il consumo del prodoo di parenza e la formazione del prodoo della fermenazione (produzione penicillina: la formazione del prodoo è massima quando la crescia del microrganismo e il suo consumo di glucosio e di ossigeno diminuiscono sensibilmene). Bioecnologie avanzae Grazie alle ecniche dell ingegneria geneica è oggi possibile, uilizzando paricolari enzimi dei di resrizione, agliare il DA di una cellula in puni paricolari per inserirvi nuovi geni che consenano alla cellula sessa si svolgere deerminae funzioni (ecnica del DA ricombinane). Quesa ecnica ha moliplicao enormemene le possibilià di uilizzo delle bioecnologie soprauo nei seori agricolo e farmaceuico. L Ingegneria geneica perano consene di rasferire pari di DA da un organismo ad un alro, in genere un baerio o un lievio, in grado di accearlo e di esprimerlo correamene, con l obieivo di: Esrarre e/o purificare il prodoo proeico espresso dal gene all inerno del nuovo ospie per oenere proeine di ineresse per l uomo Colivare microrganismi e piane o allevare animali che esprimono il gene eerologo inserio per la produzione di: 1. Microrganismi per la bioindusria 2. Piane e animali ransgenici più resiseni alle malaie, all ambiene e più produivi o in grado di produrre, nel caso degli animali ransgenici, sosanze uili all uomo (proeine, enzimi, ecc.) Il mercao Il mercao dell indusria bioecnologica può essere suddiviso in 4 seori principali: 1. Salue umana Anibioici, Ormoni, Vaccini, Immuno regolaori 2. Prodoi per l agricolura Pesicidi, Funghicidi, Erbicidi 3. Prodoi per l alimenazione Bevande alcoliche, Dolcificani, SCP (single cell proein) 4. Prodoi chimici Viamine, Amminoacidi e proeine, Enzimi Scala dei processi I processi bioecnologici possono essere classificai in: Piccola scala viamina B12, vaccino poliomelie, glucoso isomerasi Media scala penicillina, cefalosporina, srepomicina, enzimi exracellulari Larga scala eanolo, polisaccaridi, SCP Per i primi (piccola e media scala) la qualià del prodoo è il faore principale piuoso che l economia del processo. Tui i processi, indipendenemene dalla dimensione produiva dell impiano, possono essere realizzai in maniera coninua o disconinua. La scela, olre che dipendere dal faore di scala, dovrà ener cono di due aspei peculiari delle produzioni bioecnologiche: 1. Serilià del sisema (difficile da manenere per empi prolungai) 2. Sabilià della colura microbica (che non deve degenerare, dando origine a muazioni, e manenere una aivià di sinesi sempre elevaa) Schema di un processo fermenaivo Qualunque processo bioecnologico può essere suddiviso in re pari: 2

3 1. Operazioni che precedono la fermenazione, ovvero ui gli sadi di preparazione del subsrao, dell inoculo e, per i processi aerobi, dell aria 2. La fermenazione vera e propria 3. Sadi successivi alla fermenazione, ossia ue le operazioni di separazione dei prodoi di reazione dal subsrao residuo (brodo di fermenazione esauso) e dalle cellule (biomassa) Maerie prime Le maerie prime uilizzae nei processi bioecnologici sono in genere o prodoi di origine vegeale (cereali, frua, lae e derivai, ecc.) o scari di lavorazione e sooprodoi dell indusria agroalimenare (melasso, acque di macerazione del mais (corn seep liquor), acque di vegeazione, ecc.). Se il processo è condoo con cellule viveni la maeria prima deve conenere principalmene carbonio insieme ad azoo, fosforo, viamine e micronurieni. La fone di carbonio primaria sono i carboidrai, semplici e complessi. Alre foni sono cosiuie da alcoli, polialcoli e derivai del perolio. L azoo può essere fornio sia in forma inorganica che organica. Il maeriale di parenza deve essere preparao per essere uilizzao come subsrao dai microrganismi. E imporane infai lavorare con maeriale fluido o semifluido per agevolare una serie di funzioni del reaore come la disribuzione omogenea dei reageni e dei prodoi, la diffusione dell ossigeno o di alri gas, il rasferimeno di calore. Anche l acqua uilizzaa deve essere raaa, in paricolare deve essere priva di microrganismi e sosanze quali mealli pesani, alamene ossici per le cellule impiegae nel processo. Per queso si uilizza acqua deionizzaa a bassissima conducibilià e per i maeriali uilizzai nella cosruzione di ubazioni, valvole, serbaoi, girani di pompe, ecc., si devono eviare il rame e le sue leghe e gli acciai al carbonio. I preraameni sulle maerie prime comprendono: macinazione, coura, filrazione, cenrifugazione ed alri ancora. Inolre poiché il maeriale di parenza porebbe essere conaminao da organismi compeiori, può essere necessaria una serilizzazione. Serilizzazione Tui i microrganismi possiedono un range di emperaura oimale per cui, a emperaure più basse, il loro meabolismo viene bloccao, menre, ad ale emperaure, vengono uccisi. Su queso si basa la serilizzazione ermica, che consise nell esporre il mezzo da serilizzare a emperaure elevae per un empo sufficiene a ridurre la carica baerica enro valori acceabili. Perano al di sopra di una emperaura massima, caraerisica di ciascun microrganismo, si osserva l arreso dell aivià meabolica, poi della moliplicazione, seguono danni irreversibili e quindi la more. ell ordine la resisenza aumena da psicrofili, psicoropi, mesofili, ermofili. I faori che influenzano la resisenza al calore, olre al ipo di microrganismo, sono: Temperaura oimale di moliplicazione Tempo e emperaura del raameno Presenza di forme vegeaive e/o di spore Fase di crescia nella quale si rovano i microrganismi (fase di moliplicazione logarimica) umero iniziale di microrganismi (si osserva infai che una maggiore resisenza al calore e ad alri ageni dannosi con una popolazione microbica numerosa per la formazione di agglomerai) Caraerisiche del subsrao: conenuo in grassi, proeine, carboidrai, Sali, ph, valore a W, presenza di addiivi e animicrobici influenzano la ermoresisenza dei microrganismi (ad esempio il grasso crea un ambiene proeivo ipo quello del calore secco, la presenza di polifosfai aumena la ermoresisenza di Enerococcus faecalis) Il ipo di raameno ermico: a parià di emperaura, l efficacia della riduzione della popolazione microbica è maggiore con calore umido rispeo al calore secco (ad esempio con calore umido in 4-1 a 12 C si ha la disruzione delle spore di C. boulinum, menre con calore secco occorrono 12 ) La maggior pare dei microrganismi ossici sono mesofili (es. salmonella, boulino), mesofili sono anche la maggior pare dei Gram+, poche specie apparengono al gruppo dei ermofili: ra quese alcune specie dei generi Bacillum e Closridium le cui spore sono paricolarmene resiseni e possono resisere anche alla serilizzazione. Ad esemio sopravvivono per più ore a 1 C menre il raameno a 12 C per più minui le uccide (o 13 C se sono specie ermofile). La maggior pare dei baeri vegeaivi, quindi, è uccisa a emperaura ra 55 e 65 C, lievii, muffe e spore di muffe sono in genere ermosensibili come i baeri vegeaivi e sono disrui a parire dai 55 C. Si è viso sperimenalmene che il decremeno del numero di microrganismi (e di spore) con la emperaura (se quesa corrisponde ad un valore leale) segue una cineica del I ordine: d - = k d d d - = k d - = k d 2.33 ln = k ln = k 2.33 log = k 2.33 k log = = 2.33 D D è il empo di riduzione decimale ossia il empo necessario affinché: 3

4 = D log = 1 = 1 il numero di cellule o di spore si riduca ad 1/1 del valore iniziale. Si noi che la cosane cineica k (e quindi D), dea cosane di esinzione, è funzione sia del ipo di microrganismo che della emperaura (assumendo valori sempre più elevai all aumenare di quesa) a cui viene eseguia la serilizzazione ed è ricavabile per via sperimenale 1. Esprimendo log in funzione di avremo: log = log D Se chiamiamo il valore del empo ale che log = : 7 6 log Log log = log D Tempo ma = D log, ossia il valore di dipende da quello di : 7 6 log 1 5 log 2 Log 4 3 log Tempo Se lo sesso grafico venisse racciao in scala decimale, avremmo: 1 La rsisenza al calore (D) è, in effei, non solo una proprieà specifica del ceppo ma dipende anche da: Sao delle cellule (in fase logarimica la resisenza è minore) Subsrao (ph, a W, sosanze proeive). A valori di ph ra 6 ed 8 c è la massima resisenza; più basso il ph minore è la ermoresisenza, più bassa a W maggiore è la ermoresisenza 4

5 Tempo Si oiene così una curva che ende asinoicamene a (ossia per ), ciò significa che non esise una serilià assolua. La serilià viene quindi definia in modo praico: un ambiene è serile, ossia privo del microrganismo in quesione, dopo che lo sesso è sao manenuo alla emperaura leale selezionaa per un periodo di empo pari al empo di more ermica TDT (Thermal Deah Time) del microrganismo, dao da TDT = 12 D ossia dopo che è rascorso un inervallo nel quale il conenuo di cellule (o, per meglio dire, spore) è diminuio di un faore Infai: TDT 12 D log = = = 12 D D 12 = 1 Se l ambiene in parenza coneneva 1 12 spore (millemiliardi di spore), rascorso il empo di serilizzazione ne conerrà 1 solano. Parimeni nel caso il valore di fosse sao 1 11, il numero di spore finali sarebbe sao 1-1 e così via. Sembra srano il fao che il numero di spore residue possa assumere valori decimali inferiori ad 1, uavia l incongruenza scompare se pensiamo ad (numero di spore preseni nel sisema sooposo a serilizzazione) come concenrazione di spore, ossia spore per unià di volume, dove alla parola volume assegniamo il significao di coneniore. Un valore di pari a 1-1 significherà, in alri ermini, non.1 spore per coneniore bensì 1 spora residua presene in un coneniore ogni 1 e, analogamene, = 1-2 indicherà 1 coneniore conaminao (da 1 spora) ogni 1 e così via. Il empo di more ermica dipende, come quello di riduzione decimale D, dal ipo di microrganismo e dalla emperaura scela per serilizzare l ambiene. Considerando, ad esempio, 3 emperaure diverse oerremo sperimenalmene 3 valori differeni di TDT: log 1 Log TDT3 TDT2 TDT Tempo Diagrammando il logarimo di TDT in funzione della emperaura avremo: 5

6 1 TDT 1 F T=121 C Temperaura [ C] Si definisce faore di serilizzazione F il TDT corrispondene ad una emperaura di riferimeno (in genere 25 F = 121 C). Dal grafico di deduce che : logtdt logf = m ( T 121 C) E, ponendo: 1 m = z (**) TDT 121 T log = F z z corrisponde all inervallo di emperaura a parire da 121 C per il quale : TDT log = 1 F ossia TDT = 1 F. Dalla (**) oeniamo: 121 T TDT = F 1 z Riornando all espressione cineica iniziale: d - = k d d k = k d 2.33 d = d 2.33 D d = d = d D TDT 12 ln = d TDT d 121-T log 12 1 z = F log = 12 d TDT d = T F 1 z Se quindi il profilo di emperaura vs empo del nosro sisema dà luogo ad un inegrale uguale al faore F avremo: log = 12 ossia il sisema è sao serilizzao. Riassumendo, per F si inende il numero di minui in cui, a C, viene raggiuno un effeo leale sul germe guida, equivalene alla somma degli effei leali dell inero processo di serilizzazione se queso, come di solio accade, è condoo a emperaure variabili nel corso del empo. Per valori di emperaura diversi da 121 C, il valore di F si riferisce a una emperaura posa a pedice, ed un valore z poso in apice (normalmene pari a 1 C). Il germe guida viene scelo in base al ipo di processo per il quale si effeua la serilizzazione. Ad esempio, nella proezione conro le inossicazioni alimenari il germe di riferimeno è il Closridium boulinum, il più pericoloso agene di inossicazione alimenare, le cui spore anaerobie hanno la più fore ermoresisenza ra i paogeni ed il cui valore di D 121 è pari a.21 minui. Per 6

7 effeuare una serilizzazione occorrerà manenere per un periodo F = 12 D = 12.21min = 2.52min ~ 3min il prodoo da serilizzare a 121 C (o per un periodo equivalene se la emperaura durane il riscaldameno non rimane cosane). ella proezione conro le alerazioni dei prodoi alimenari nei paesi ropicali, il germe di riferimeno è il B. searohermophilus che possiede una ermoresisenza superiore a quella delle spore del C. boulinum (D 121 da 4 a 5 minui). I fermenaori I fermenaori e i relaivi sisemi di conrollo e regolazione sono gli apparai fondamenali degli impiani indusriali per processi che prevedono la crescia di microrganismi. Sono infai recipieni in cui ha luogo la crescia microbica. Esise poi ua una sede di apparecchiaure con cui si compiono le operazioni preliminari sul brodo di colura e sull inoculo e, alla fine del ciclo, le operazioni erminali per raare e purificare in vario modo il prodoo della fermenazione, sia queso un anibioico, un enzima o la sessa biomassa (cioè l'insieme delle cellule microbiche). Ci occuperemo quindi dei fermenaori in quano unià fondamenali degli impiani, riporando innanziuo alcune osservazioni generali sui parameri chimico-fisici che influenzano le fermenazioni indusriali. Temperaura La crescia di un microrganismo in condizioni indusriali ende ad innalzare la emperaura della colura soprauo a causa dello sfavorevole rapporo massa/superficie dei fermenaori che impedisce un efficace dispersione di calore; nauralmene la crescia produce calore anche in condizioni di laboraorio dove però i piccoli volumi usai ne consenono una rapida dissipazione, ano che le colure debbono essere ermosaae per riscaldameno. el caso indusriale la siuazione è opposa; le colure debbono essere raffreddae affinché la emperaura rimanga cosane all'opimum richieso per la crescia del microrganismo; queso è vero a maggior ragione nel caso delle "fermenazioni aerobie" in cui è maggiore la quanià di calore prodoo a causa della maggiore efficienza energeica del meabolismo aerobio (circa 124 kcal/mole O 2 ). La differenza di emperaura ra i fermenaori e l'ambiene non è molo elevaa e queso rende la rimozione di quesa rilevane quanià di calore un procedimeno relaivamene cososo dao che bisogna usare grandi quanià di acqua (con le connesse implicazioni ecologiche: polluzione ermica) o sisemi refrigerani più drasici che richiedono noevole dispendio energeico. I meodi più usai consisono nel far circolare acqua (o alro fluido refrigerane) in una inercapedine (camicia) che avvolge uo il fermenaore oppure in serpenine messe direamene all'inerno del fermenaore. el caso delle fermenazioni più esoermiche si preferisce far circolare, a mezzo di apposie pompe, il brodo di colura ra il fermenaore e uno scambiaore di calore (apparecchiaura in cui è molo efficace lo scambio di calore ra 2 fluidi) alimenao con fluido refrigerao. In ui i casi sisema di raffreddameno è comandao e regolao auomaicamene da un sisema di conrollo della emperaura all'inerno del fermenaore. Ossigeno È un problema esremamene imporane per le fermenazioni aerobie e in ceri casi può divenare addiriura il faore limiane. L'ossigeno può essere disponibile per le cellule solo quando si rova in soluzione e deve essere coninuamene rifornio mediane bolle di aria che si fanno gorgogliare nel brodo di colura; specialmene imporane è la velocià di rasferimeno dell'ossigeno dalle bolle d'aria al mezzo liquido (cioè la velocià di dissoluzione del gas) che dipende, a parià di alre condizioni, dalla superficie delle bolle e dalla differenza ra la pressione parziale dell ossigeno in fase gassosa (aria) e la pressione che, in base alla legge di Henry, corrisponderebbe alla effeiva concenrazione di O 2 in fase liquida (erreno). Queso significa che per oenere un'oima velocià di dissoluzione bisognerebbe usare ossigeno puro o aria arricchia di ossigeno per aerare i fermenaori, però i cosi addizionali necessari rendono queso ipo di soluzione non economica dal puno di visa indusriale. Generalmene la parziale soluzione del problema viene affidaa ad accorgimeni cosruivi dei fermenaori che esamineremo in deaglio più avani, comunque l'orienameno è sempre quello di manenere al più basso livello possibile "la spesa energeica" per unià di volume di ossigeno disciolo. ella abella seguene si possono confronare le diverse velocià di dissoluzione dell'ossigeno oenue in alcuni ipi di fermenaori, i valori sono espressi in kg di ossigeno disciolo per m 3 di erreno per ora. Paricolare aenzione è dedicaa ad oenere che la velocià di dissoluzione dell'ossigeno sia abbasanza uniforme in ui i puni del fermenaore onde eviare la formazione di "sacche" anaerobie in cui la crescia ed il meabolismo del microrganismo sarebbero noevolmene diversi rispeo al resane volume del fermenaore. Tipo Velocià di dissoluzione Fermenaori "Airlif" Fermenaori "Airlif" con ubo sommerso Fermenaori con agiazione meccanica 4 Serilizzazione I problemi riguardani queso processo su scala indusriale provengono essenzialmene da due faori: 7

8 dalla massa di erreno che è necessario serilizzare, le cui dimensioni sono ormai giganesche (ad esempio i fermenaori di una moderna indusria possono avere capacià fino ad un milione di liri ciascuno); dagli effei del riscaldameno su alcuni componeni del erreno; è noa infai la ermolabilià delle viamine; esise anche la possibilià di reazioni indesiderae soprauo ra glucosio e amminoacidi. I moderni meodi di serilizzazione prevedono l'uso di ale emperaure per periodi di empo molo brevi, procedimeno, queso, che consene di minimizzare le alerazioni della composizione chimica del erreno e che viene realizzao da apparecchiaure a flusso coninuo. In praica la serilizzazione si oiene immeendo vapore di acqua soo pressione in un flusso cosane di erreno freddo; dopo un cero percorso (e quindi un cero empo) la emperaura raggiuna assicura la serilià: un sensore rivela la emperaura raggiuna dal erreno e regola di conseguenza il flusso del vapore all'ingresso. I sisemi di conrollo possono essere anche più raffinai e regolare anche il flusso del erreno olre che quello del vapore; lo scopo è sempre quello di eviare un surriscaldameno del erreno, sia per le ragioni appena esaminae che per limiare gli sprechi di vapore (cioè di energia). La serilizzazione a freddo mediane filrazione, non è, almeno aualmene, un meodo praicabile su scala indusriale a causa dei cosi proibiivi che richiede ed inolre sono ancora da risolvere problemi derivani dall'uso di erreni complessi, spesso con solidi in sospensione. Le condizioni operaive dei fermenaori sono piuoso blande rispeo a quelle dei procedimeni puramene chimici: emperaura e pressione in genere non sono molo lonane dai valori ambienali e i valori di ph sono usualmene vicini alla neuralià. In genere quindi i problemi ecnologici per la cosruzione dei fermenaori non riguardano la resisenza alle solleciazioni meccaniche o alla corrosione, ma piuoso il manenimeno della serilià e la prevenzione dagli inquinameni o, in alcuni casi, una oimale disribuzione e dissoluzione dell'aria insufflaa. Le superfici inerne sono lisce e levigae per minimizzare la possibilià di adesione di "pellicole" dei microrganismi in crescia. La progeazione deve anche enare di approssimare una geomeria ideale ad esempio limiando, ovunque possibile, angoli, cavià, spigoli vivi che porebbero corrispondere a "zone more" cioè zone in cui il microrganismo meabolizza in modo diverso; inolre quese zone sono in genere meno accessibili ai procedimeni di pulizia e serilizzazione. Aualmene i fermenaori vengono cosruii in acciaio inossidabile o in acciaio normale con rivesimeno inossidabile. Esaminiamo ora schemaicamene alcuni ra i più diffusi ipi di fermenaori. Fermenaori ad agiazione meccanica (sirred fermeners). Tipo convenzionale: è probabilmene il più diffuso. L'aspeo ipico dei fermenaori di quesa caegoria è quello di recipieni cilindrici con un asse cenrale su cui sono monae le pale di agiazione, spesso di disegno molo complicao, che creano la urbolenza necessaria per disperdere l'aria ed agiare il erreno. In genere è previsa ua una serie di pale pose lungo l'asse a disanze che corrispondono a 1-2 vole il loro diamero il quale a sua vola è generalmene 1/3 del diamero del fermenaore. Il puno di ingresso dell'asse nel fermenaore è il puno debole di queso modello per quano riguarda la possibilià di conaminazioni e paricolare cura viene dedicaa alla sua realizzazione meccanica. L'aria è immessa nel fermenaore mediane disposiivi con fori accuraamene calibrai subio al di soo dell'ulimo gruppo di pale, sul fondo del fermenaore. Queso ipo è sao finora cosruio fino alla capacià di alcune ceninaia di migliaia di liri anche se si parla di progei per dimensioni di 2 milioni di liri desinae alla produzione di biomasse da derivai peroliferi. Tipo Vogelbusch: in queso ipo l aria è pompaa araverso l'asse di agiazione, che è cavo, e giunge alle pale, le quali porano più serie di fori di,5 millimeri di diamero. Il sisema di agiazione ruoa a velocià variabili ra 2 e 1 giri/min disperdendo così le bollicine d'aria. Sembra che queso ipo abbia noevoli problemi meccanici derivani dall'usura dei sisemi di sosegno dell'asse di agiazione. I più grandi finora cosruii hanno la capacià di 25 mila liri e si pensa che il loro limie cosruivo sia inorno ai 3 liri; vengono usai soprauo per la produzione di lievio da melassi. Tipo Waldhof: in queso modello l aria è pompaa araverso l'asse di agiazione (cavo) e le pale sono anch'esse cave e apere solo all'esremià; subio al di sopra del sisema di pale, e coassiale al sisema di agiazione, si rova un ubo apero alle due esremià e di diamero approssimaivamene uguale sisema di pale dell'agiazione; l'aria emerge in bolle giuso di soo del bordo inferiore del ubo. La roazione del sisema di pale crea un vorice nel ubo che aira in basso e rimescola la schiuma che si forma in superficie. Queso flusso inolre aumena l aereazione migliorando la dispersione delle microbolle d'aria nel erreno. Il vorice infine diminuisce la pressione idrosaica sull aria in uscia all'esremià delle pale e quindi riduce la richiesa di energia per i compressori del sisema di aereazione. È molo usao nella produzione di lievio. Fermenaori "Airlif". Quesa classe di fermenaori è basaa sul conceo che il sisema di aereazione provvede anche all'agiazione del erreno e alla disribuzione delle bolle d'aria. Tipo a orre: è la forma più semplice, praicamene un cilindro vericale con rapporo alezza/diamero di almeno 6:1, che ermina in alo con uno svasameno e una cora sezione di diamero maggiore per faciliare l'abbaimeno della schiuma. Il erreno enra dal basso e fluisce verso l'alo da dove viene prelevao in coninuo, queso funzionameno si può approssimare quello di un reaore ubolare a flusso coninuo; anche l ingresso per l'aria è sul fondo araverso placche di vero poroso che producono bolle di piccolissime dimensioni. Vengono usai nella produzione di lievii; è allo sudio la possibilià di cosruzione in maeriali sineici per fermenaori di piccole capacià; quesa imposazione ecnologica sarebbe desinaa alla produzione a basso coso di biomasse (Single Cell Proein) in piccoli impiani che userebbero subsrai disponibili localmene. Tipo Lefrançois: il più diffuso di fermenaore "airlif, usa anche l'effeo di circolazione dao dal ubo sommerso (come il Waldhof); la ecnologia di cosruzione prevede due diversi arrangiameni a seconda della capacià. ei fermenaori di grande capacià il diamero del ubo sommerso è di poco inferiore al diamero del fermenaore e l'aria è immessa all'inerno dello spazio anulare compreso ra il ubo e la paree inerna del fermenaore. ei fermenaori più piccoli si preferisce la sisemazione convenzionale con il diamero del ubo sommerso che è approssimaivamene 1/3 del diamero nel fermenaore. In enrambi i casi il erreno viene immesso nelle immediae vicinanze dell'ingresso dell'aria così da aumenare la urbolenza e la dispersione dell'aria. La bassa densià dell'emulsione aria-erreno causa una spina ascendene che assicura la 8

9 circolazione del erreno secondo un verso che dipende dalla sisemazione del ubo sommerso. L efflusso del erreno esaurio è conrollao auomaicamene. È sao cosruio uno di quesi fermenaori con capacià di 1 milione di liri (per un impiano che uilizza idrolisao di semi di girasole) e la dia cosrurice dichiara di poerne cosruire fino alla capacià di 3 milioni di liri. Probabilmene un fermenaore Lefrançois è in funzione in Francia per la produzione di biomasse (SCP) da gasolio. Di recene sono sae annunciae imporani innovazioni ecnologiche per i fermenaori airlif, però finora sono noi solo alcuni schemi generali e nessun dao cosruivo. In prima approssimazione si può prevedere un sisema di circolazione eserno al corpo del fermenaore; la circolazione del erreno avverrebbe come risulao della differenza di densià di emulsioni liquido-aria, ra una correne ascendene foremene aereaa ed una correne discendene non aereaa in un ubo eserno fermenaore. Tipo convenzionale Tipo Vogelbusch Tipo Waldhof Tipo Lefrançois Anischiuma ei processi fermenaivi condoi in aerobiosi, la naura sessa dei erreni colurali e il coninuo insufflameno di aria danno luogo alla formazione di schiume elevae e persiseni che, se non conrollae, possono influire negaivamene sull'inero processo. Esse infai, riducono l'ossigenazione della colura, rascinano in superficie pare delle cellule e dei cosiueni del erreno colurale sesso, abbassando le rese in prodoo. Inolre, endendo a fuoriuscire dal fermenaore, divenano facilmene veicoli di inquinameno. La formazione e la consisenza delle schiume dipendono dalla composizione del erreno colurale (ad esempio è favoria dalla presenza di proeine, peponi, desrine, prodoi di caramellizzazione degli zuccheri, ecc.), dal ph e dalla emperaura ai quali si lavora. Durane la crescia del microrganismo, il consumo delle sosanze nuriive, la formazione dei prodoi del meabolismo e la presenza di corpi cellulari deerminano un coninuo cambiameno nello sao chimico-fisico del erreno sesso. e consegue che la schiuma può formarsi all'inizio o durane la fermenazione. Il conrollo delle schiuma, indispensabile per la buona riuscia di un processo, viene in genere oenuo aggiungendo alla colura ensioaivi opporunamene sceli. Come ensioaivi si usano in genere, olii animali o vegeali, siliconi, alcoli a lunga caena, polieeri, derivai del sorbiano, ecc. elle scele della sosanza da usare vanno enui preseni i segueni crieri: 1) deve essere poco solubile nel erreno colurale, disperdersi rapidamene in esso ed agire a basse concenrazioni; 2) non deve essere ossica per il microrganismo è non deve influire negaivamene sulla via biosineica ineressaa nella formazione prodoo; 3) deve essere serilizzabile; 4) non deve conferire odori e sapori paricolari al erreno colurale sesso. Ciò è paricolarmene imporane quando i prodoi oenui sono desinai alla alimenazione umana o animale. In queso caso, inolre, il ensioaivo non deve essere ossico nemmeno a basse dosi; 5) non deve inerferire nei processi di esrazione del prodoo. La quanià di ensioaivo da aggiungere viene in genere regolaa auomaicamene in modo da immeere nel fermenaore solo la quanià minima indispensabile. Semina Per l'inoculazione di un fermenaore bisogna usare una colura già sviluppaa per abbreviare i empi e diminuire gli inquinameni. In genere si semina ogni fermenaore con una quanià di colura pari a circa 1/1 o 1/2 del volume di colura conenuo nel fermenaore. L inoculo viene preparao in un recipiene simile al fermenaore ma di capacià minore (il germinaoio) e poi viene pompao nel fermenaore; se si pare da un ceppo liofilizzao o congelao bisogna effeuare una serie di ingrandimeni. Operazioni successive alla fermenazione. Alla fine della fermenazione il prodoo desiderao si rova diluio in alcune ceninaia di migliaia di liri di erreno di colura conenene sosanze svariae disciole olre a paricelle insolubili e cellule microbiche in sospensione. auralmene i procedimeni successivi alla fermenazione poranno essere svariaissimi a seconda della naura del prodoo e della concenrazione del prodoo sesso nella colura. Si va infai da concenrazioni molo elevae come quella dell'acido laico (13 g/l) a concenrazioni bassissime come quella della viamina B 12 (23 mg/l). Uno schema generale delle operazioni successive alla fermenazione è riporao nella figura che segue. 9

10 Eliminazione dei microrganismi e delle alre paricelle insolubili. Si raa della prima operazione da effeuare dopo la fine della fermenazione e può essere svola in vari modi. A vole basa aendere la flocculazione dei microrganismi (es. lievio) che ra l'alro rascinano con loro paricelle insolubili. In alri casi la flocculazione può essere provocaa mediane ageni che neuralizzano le cariche negaive che si rovano sulla superficie delle cellule e che ne impediscono l aggregazione. Si usano a queso scopo il solfao di alluminio o il cloruro di calcio. Si possono usare anche dei polielerolii sineici che ricoprono le cellule e formano legami con alre cellule ricopere di polielerolia. La cenrifugazione può servire a separare le cellule anche di piccole dimensioni come quelle baeriche, ma si raa di un procedimeno cososo, poco usao indusrialmene. La filrazione è il meodo più usao per allonanare i microrganismi che hanno un micelio. Si uilizzano a vole dei filripressa ma più spesso dei filri a amburo roaivi soo vuoo. A vole, ad esempio nel caso degli srepomicei, una micelio molo fine rischierebbe di rendere la filrazione molo lena. In quesi casi si aggiunge alla coura della farina fossile, o alri simili maeriali ineri, che vengono raenui insieme al micelio sulla superficie della ela filrane, menre il liquido viene aspirao dal vuoo all'inerno del amburo. Un colello fisso sacca via via il pannello che si forma sulla del filrane. Cellule di piccole dimensioni possono essere allonanae dal erreno di colura anche per floazione, aggiungendo cioè una sosanza ensioaiva e facendo gorgogliare un gas finemene disperso. Si forma una schiuma che rascina con sé in superficie le cellule microbiche. Una vola allonanae le cellule microbiche, il prodoo che ineressa deve essere recuperao dal erreno di colura per essere in seguio purificao. Le ecniche più comuni sono: la disillazione, nel caso di sosanze volaili (vedi fermenazione alcoolica); l'esrazione con solveni. Si usa spesso una esrazione coninua facendo scorrere il solvene conrocorrene rispeo al erreno di colura da esrarre. L'apparecchio usao separa poi i due liquidi per cenrifugazione; l'adsorbimeno su colonne di allumina, carbone aivo, resine a scambio ionico e così via: segue l'eluizione; la precipiazione; la filrazione su gel o su membrane. Le ecniche di purificazione variano nauralmene da prodoo a prodoo e non possono essere descrie in ermini generali. 1