u filamenti di DNA e proteine u portatori di informazioni u il DNA è ripiegato secondo un pattern preciso

Transcript

1 CITOGENETICA E LA DISCIPLINA CHE STUDIA I CROMOSOMI E LE LORO ALTERAZIONI NUMERICHE E STRUTTURALI u filamenti di DNA e proteine u portatori di informazioni COSA SONO I CROMOSOMI? u ogni cromosoma deve contenere 3 elementi essenziali: centromero, telomeri, origini di replicazione u il DNA è ripiegato secondo un pattern preciso karyotyping/karyotyping2.html u il cromosoma che analizziamo è quello metafasico EACH CHROMOSOME CONTAINS 3 ELEMENTS Il cromosoma va incontro a cambiamenti durante il ciclo cellulare Il DNA del cromosoma si ripiega in maniera ordinata 2 nm INTERPHASE CHROMATIN IS PREDOMINANTLY IN THE FORM OF A 30 nm FIBER a c c o r c i a m e n t o x 7 x 6 x 40 x 5 11 nm 30 nm 300 nm 700 nm s p e s s o r e MAR: matrix associated region 1400 nm SAR: scaffold attachment region 1

2 12/04/15 INTERPHASE CHROMATIN IS PREDOMINANTLY IN THE FORM OF A 30 nm FIBER INTERPHASE CHROMATIN IS PREDOMINANTLY IN THE FORM OF A 30 nm FIBER MAR: matrix associated region SAR: scaffold attachment region 3-20 kb kb (TTAGGG) Telomere Associated Repeats (TAR) Unique DNA Unique Telomere FISH Probe LA CITOGENETICA MODERNA NASCE 60 ANNI FA LA CITOGENETICA MOLECOLARE 30 ANNI FA cromosomi osservati al microscopio coniato il termine cromosoma determinato il N di 48 cromosomi umani il N viene corretto a definita la trisomia del introdotta la tecnica FISH 1992 introdotta la tecnica CGH 1997 introdotta la tecnica CGH array 2

3 TAPPE PRINCIPALI NELLA PREPARAZIONE DEL CARIOTIPO 1. COLTIVARE LE CELLULE sangue periferico fitoemoagglutinina (stimola la crescita) Come si procede? colchicina (ultimi 30 ) Ipotonica (20 ) 2. BLOCCARLE IN METAFASE 3. ROMPERLE MEDIANTE SHOCK OSMOTICO 4. FISSARE I CROMOSOMI 5. ESSICCARE 6. COLORARE terreno di coltura fissativo pellet risospeso proliferazione 48-96h fissativo centrifugazioni (2-3) centrifugazione risospensione in poco fissativo pellet risospeso centrifugazione allestimento del preparato PIASTRA METAFASICA (bandeggio G) CARIOGRAMMA CARIOTIPO = corredo cromosomico di un individuo (numero di cromosomi ed eventuali anomalie) CARIOGRAMMA = immagine fotografica dei cromosomi metafasici disposti ordinatamente Come si riconoscono i cromosomi? I cromosomi vengono identificati in base: (1) alla loro lunghezza (2) alla posizione del centromero (3) al bandeggio 3

4 Struttura del cromosoma sub-metacentrico acrocentrico telomeri satelliti telomeri braccio P centromero centromero centromero braccio Q braccio Q braccio Q telomeri telomeri telomeri LA COLORAZIONE DEI CROMOSOMI: IL BANDEGGIO BANDE METODO DI COLORAZIONE G GTG, GAG GIEMSA (dopo trattamento con enzimi proteolitici o soluzioni saline) Q QF, QFQ, QFH QUINACRINA R RHG,RH,RF GIEMSA (dopo trattamento con soluzione RB,RBG,RBA salina calda o arancio di acridina o BrdU combinato con Giemsa o acridina) C CB, CBG GIEMSA (dopo trattamento con idrossido di bario) Ag-NOR, Perche i cromosomi si presentano bandeggiati? CARIOGRAMMA bandeggio G Fissati su un vetrino e colorati con colorante Giemsa assumono un aspetto a strisce perche vengono colorate le regioni di DNA piu ricche in Adenina e Timina. 4

5 12/04/15 CARIOGRAMMA bandeggio Q Ideogramma dei cromosomi umani Il cromosoma 8 a diverse risoluzioni di bandeggio In base alle dimensioni, i cromosomi umani sono stati numerati da 1 a 22. Esiste, inoltre, una coppia di cromosomi, X e Y, che determina il sesso. 450 bande IDEOGRAMMI DEL CROMOSOMA bande 850 bande CARIOGRAMMA bandeggio G 10mm 200 Mb di DNA 5

6 Cariotipo femminile a 500 bande Cariotipo maschile a 600 bande A cosa serve l analisi del cariotipo? A rivelare alterazioni cromosomiche costituzionali Diagnosi prenatale Diagnosi postnatale A rivelare alterazioni cromosomiche somatiche Diagnosi onco-ematologica DIAGNOSI PRENATALE A chi: Alle gestanti con aumentato rischio di avere un figlio con cromosomopatia Quando: dalla 10a alla 21a settimana di gestazione Come: Con un prelievo di villi coriali (10-11w), liquido amniotico (16-18w), sangue fetale (19-21w). DIAGNOSI POSTNATALE A chi: Ai soggetti, adulti o bambini con: Ritardo mentale e/o dismorfismi Sospetto clinico di trisomia, microdelezione o comunque di malattia cromosomica Alle coppie con problemi di infertilita In soggetti con patologia onco-ematologica per riconoscere mutazioni somatiche Come: Con un prelievo di sangue periferico in eparina QUALI SONO LE ALTERAZIONI RILEVABILI CON L ANALISI CITOGENETICA ANOMALIE NUMERICHE DEI CROMOSOMI POLIPLOIDIE > corredo cromosomico multiplo dell aploide (superiore al diploide) e.g. TRIPLOIDIA ANEUPLOIDIE > le più frequenti aberrazioni numeriche dovute a non-disgiunzione meiotica o post-zigotica monosomie degli autosomi sono incompatibili con la vita poche trisomie sono compatibili con la sopravvivenza aneuploidie dei cromosomi sessuali sono tollerate MOSAICISMI ANOMALIE STRUTTURALI DEI CROMOSOMI RIARRANGIAMENTI STRUTTURALI > delezioni, duplicazioni, traslocazioni, inserzioni, inversioni pericentriche e paracentriche, isocromosomi MARKERS CROMOSOMICI RINGS 6

7 Cariotipo triploide triploidia Frequenza alla nascita = 1/ Frequenza negli aborti = 1/14 Cariotipo 69,XXY 57% Cariotipo 69,XXX 40% Cariotipo 69,XYY 3% Tipo I, corredo sovrannumerario paterno Feto microcefalico o normale Placenta ingrossata Tipo II, corredo sovrannumerario materno Ritardo di crescita Feto con macrocefalia relativa Placenta poco sviluppata Nati vivi Basso peso Asimmetria cranio-facciale e difetti di ossificazione del cranio Microftalmia, ipertelorismo, micrognazia Sindattilia cutanea, piedi torti Anomalie genitali, ipoplasia delle surrenali Cardiopatie Le aneuploidie I CROMOSOMI SONO CAUSA DI ANEUPLOIDIE CON FREQUENZE DIVERSE Nullisomia Monosomia Disomia Trisomia Tetrasomia Combinazioni delle prcedenti 7

8 Per comprendere le aneuploidie occorre ricordare mitosi e meiosi MALE AND FEMALE GAMETOGENESIS ARE DIFFERENT Males 1 primary spermatocyte 4 gametes Spermatogonia and stem cells renewed active production of sperm during life Females 1 primary oocyte 1 egg and 2 polar bodies Born with all oocytes ova released between the ages of years SPERMATOGENESI E OOGENESI Female human embryo Stages in gonad 2 months gestation oogonia start meiosis 5 months arrest in meiosis I 6 months chromosomes held together by chiasmata By puberty 100,000 remain Maximum mature Aneuploidy caused by Non-disjunction during meiosis Non-disjunction failure of homologous chromosomes to separate in anaphase I failure of sister chromatids to separate at meiosis II Anaphase lag Chromosomal loss via micronucleus formation caused by delayed movement of chromosome/chromatid during anaphase results in daughter cell deficient of that chromosome or chromatid 8

9 Parental origin of aneuploidy Paternal % Maternal % Trisomy Trisomy Trisomy ,X ,XXX ,XXY ,XYY Chromosome abnormalities in humans Spermatozoa 10% Mature oocytes 25% Spontaneous miscarriage 50% Live births 0.5-1% Most due to maternal meiotic non disjunction Strongly related to maternal age Natural selection at work COSA E UN MOSAICISMO QUALI SONO LE ALTERAZIONI RILEVABILI CON L ANALISI CITOGENETICA E la coesistenza di linee cellulari con cariotipo alterato e linee cellulari con cariotipo normale in percentuale variabile. La gravità del fenotipo non è necessariamente legata alla percentuale di mosaicismo. COME SI RICONOSCE UN MOSAICISMO A BASSA PERCENTUALE L analisi citogenetica di almeno 12 cloni cellulari in diagnosi prenatale e di almeno 20 cellule in postnatale permette di escludere mosaici superiori al 23% con un livello di confidenza di 0,95. ANOMALIE STRUTTURALI DEI CROMOSOMI RIARRANGIAMENTI STRUTTURALI > delezioni, duplicazioni, traslocazioni, inserzioni, inversioni pericentriche e paracentriche, isocromosomi MARKERS CROMOSOMICI RINGS DELETION DUPLICATION 9

10 TRANSLOCATIONS RECIPROCAL ROBERTSONIAN INSERTION INVERSION ISOCHROMOSOME RING 10

11 Quali sono le cause dei riarrangiamenti strutturali? Cariotipo con delezione 5p Sindrome Cri du Chat COSA SONO I MARKERS CROMOSOMICI? Sono piccoli frammenti cromosomici spesso non identificabili con tecniche di citogenetica classica. Si identificano con tecniche di ibridazione in situ (FISH) marker CONSULENZA: Effettuare cariotipo parentale per determinare se il marker è ereditato o de novo. Un marker de novo aumenta molto il rischio di fenotipo patologico RING?? marker 11