ENEA - Dipartimento Biotecnologie, Agroindustria e Protezione della Salute Responsabile scientifico: Dott.ssa Paola CRINÒ

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1 UNITÀ OPERATIVA N ENEA - Diprtimento Biotenologie, Agroinustri e Protezione ell Slute Responsile sientifio: Dott.ss Pol CRINÒ Altri prteipnti: Dott. Sergio Luretti, Dott.ss Florin Fiohetti, Dott.ss Mriinoront Roselli, Sig.r Giovnn CICCOTTI PROF. Emiio ALBERTINI*, DOTT. Lorenzo RAGGI* *Università egli Stui i Perugi CARATTERIZZAZIONE BIO-AGRONOMICA E MOLECOLARE DI LINEE DI CECE E LUPINO AZZURRO Relzione finle 0 luglio luglio 009 Obiettivo: rtterizzzione un punto i visto gronomio e moleolre i linee i ee e lupino zzurro in vnzto stio i selezione. L ollezione i ee, ostituit 7 linee i ostituzione Università egli Stui ell Tusi- ENEA llevte presso i mpi sperimentli ell Azien Agrri Dimostrtiv ARSIAL i Trquini, è stt rtterizzt on mrtori moleolri AFLP. Durnte il semestre i ttività el progetto, er stt già effettut l nlisi morfologi elle stesse linee su pinte veri he è stt suessivmente omplett on i ti su pinte mture in lortorio. Le linee i ee sono stte inoltre sottoposte sggi i resistenz A. riei, effettuno inoulzioni rtifiili on un sospensione onii el fungo ( 0 spore ml - ) su pintine i -0 gg. in mbiente ontrollto (ell limtizzt + C e 6 h lue/8 h buio). Dopo gg. ll inoulzione, è stt vlutt l inienz ei sintomi seono l sl 0- sviluppt Port-Pugli et l. [996, Plnt Disese 80 (): 9-] in ui sono stte inite on 0 le pinte sne e on quelle morte. L ollezione i lupino zzurro er invee ostituit un primo gruppo i 7 linee (un resimento eterminto e le ltre portmento ineterminto), rtterizzte un punto i vist morfologio ompleto (pinte veri in mpo e pinte sehe in lortorio) e moleolre on mrtori AFLP (urnte il I semestre si er vvit l mess punto ell teni), e un seono gruppo i 0 nuove linee su ui è stt effettut l sol rtterizzzione morfologi. In entrmbi i si, le pinte sono stte llevte nei mpi sperimentli ell Azien Agrri ittio imostrtiv ell Università ell Tusi i Viterbo (ollorzione on l U.O. UNITUS-GEMINI), insereno nell prov le vrietà europee Arell e Borut ome ontrolli. Per l rtterizzzione biogronomi ei genotipi i lupino ( pinte per singolo genotipo e pinte per ognun elle tre

2 replihe) e ee, sono stti onsierti i prmetri esrittivi inlusi nell list i esrittori preispost Bioversity Interntionl e in prte utilizzti urnte il semestre i ttività. Sulle stesse pinte nlizzte un punto i vist morfologio, sono stti rolti mpioni i foglie immeitmente l i sotto el germoglio pile impiegre per l estrzione el DNA. Il mterile rolto è stto ongelto -80 C in ttes i essere utilizzto per l estrzione el DNA. L nlisi AFLP è stt effettut nel seguente moo: per ogni mpione nlizzto, il DNA totle (00 ng) è stto ristretto, ligto e pre-mplifito seono l proeur sviluppt Vos et l. (99). Le mplifizioni sono stte eseguite in 0 μl i un misel i rezione ontenente /00 el DNA pre-mplifito, 0 ng el primer fluoresente EoRI+ oligonuleotii selettivi, 0 ng ell oligo non mrto MseI (T. ), μl 0X i buffer PCR (Invitrogen), 0. mm NTPs, 0. U i Tq polimersi (Invitrogen). E stto inoltre enturto μl i ogni mpione e ftto orrere su sequenzitore pillre ABI 0xl (Applie Biosystems). Un lous AFLP è stto onsierto polimorfio quno l bn mplifit er presente per luni mpioni e ssente per ltri, mentre er monomorfio se l bn er presente per tutte le essioni vlutte. Per evitre un sottostim elle ffinità genetihe, sono stti onsierti tutti i loi, polimorfii o no. I frmmenti AFLP sono stti ontrssegnti ome (presenz i bn) e 0 (ssenz i bn) utilizzno il softwre Genempper,0 (Applie Biosystems), e suessivmente sono stti inseriti in un mtrie i ti. E stt lolt un stim i similrità geneti (GS) utilizzno il oeffiiente DICE i similrità (Die 9) seono l formul GS (ij) = / ( + b + ), ove per GS (ij) si ini l similrità geneti tr iniviui i e j, per il numero i bne polimorfihe he sono onivise i e j, per b il numero i bne presenti in i e ssenti in j, e per il numero i bne presenti in j e ssenti in i. L similrità geneti tr gli iniviui è stt rppresentt on un enrogrmm bsto sul metoo UPGMA (Unweighte Pir-Group Metho of Arithmeti Averge). Le nlisi sono stte effettute utilizzno il softwre NTSYS-p (Numeri Txonomy n Multivrite Anlysis System) versione. (Rolf, 99). RISULTATI ANALISI MORFOLOGICHE SU LUPINO AZZURRO In Fig. sono riportti i enrogrmmi i similrità ottenuti on i ti morfologii ompleti, rilevti su pinte veri e su pinte mture, ui si evine l bss vriilità geneti presente tr le 7 linee ( gruppo) i lupino zzurro.

3 Fig. Denrogrmm ottenuto meinte nlisi luster (Averge Linkge metho between groups) sull bse ei ti morfologii ompleti rilevti sul gruppo i linee i lupino zzurro I vlori mei i isun rttere biogronomio, rilevti sul gruppo i 0 linee sono stti riportti in T.. I ti morfologii elle linee vlutte, l mggior prte portmento eterminto, hnno evienzito un ert vriilità per ognuno ei rtteri onsierti. L line 9B, l più bss tr quelle nlizzte, h mostrto in prtiolre l imensione mggiore ei belli tr l ltro on un posizione più lt el bello, quest ultimo prmetro fvorevole ll rolt meni. L line 0 A invee, tr le più lte, è risultt nhe interessnte un punto i vist ell potenzilità prouttiv ssoit si l numero i brnhe he ll imensione ei belli. T. - Tell ei rtteri biogronomii rilevti sul gruppo i genotipi i lupino zzurro Line Altezz pint (m) Brnhe (n.) Fiori (n.) Belli (n.) Lungh. belli (m) Lrgh. belli (m) Altezz I bello (m) Pubes. stelo Colore Cerosità stelo stelo Dimetro fogli (mm) 66-6,±,68,±0,6 0,0+0,00,±,6,0±0,6,±0,0 8,±,,00,00,00 7,±,0 7,±,6,9±0,,7±, 6,9±,,±0,7,±0,0 9,±,,00,00,00 6,7±, 6-67,0±,,9±0,,±0, 8,±,,±0,0,±0, 8,±,9,00,00,00 6,±,8 8A 78,±,0,±0,,0±0, 0,±0,87,±0,,±0,0,±0,9,00,00,00 6,6±0,99-7,±,0,±0,8 0,0±0,00 0,±,,±0,,±0,0,7±,77,00,00,00,±,6 0A 8,±,,±0,6,9±0,0,8±,6,±0,,±0,0,±0,8,00,00,00,7±, 7A 8,±,6,0±0,6,±0, 7,±,0,±0,,±0,0,9±,8,00,00,00 7,9±,0 66-6,8±,68,0±0,,±0,7,6±,09,±0,,±0,09 6,8±,9,00,00,00 7,8±,7 66-9,±,0,9±0,7 0,0±0,00,±,8,±0,6,±0,0,0±,8,00,00,00,9±,7

4 9B,+,7,8±0,,±0,9,±,8,7+0,,+0,0,+,,00,00,00 6,0+,60 Sull bse ei rtteri morfologii rilevti e omputti on il softwre SPSS vers., è stto ottenuto un enrogrmm i issimilrità meinte nlisi luster on metoo Averge Linkge ui si evine he le linee i lupino, nhe in questo so, hnno onfermto un bss vriilità tr loro istinguenosi soltnto in ue sub-lusters (Fig. ). I vlori i issimilrità, lolti ome istnze qurtihe Euliee, osillvno 0 0, evienzino un vriilità reltivmente bss tr le linee rtterizzte. Fig. Denrogrmm ottenuto meinte nlisi luster (Averge Linkge metho between groups) sull bse ei ti morfologii rilevti sul gruppo i linee i lupino zzurro Anhe per le 7 linee i ee, sull bse i tutti i rilievi morfologii rilevti si su pinte veri in mpo he su pinte mture in lortorio, è stto ostruito il enrogrmm i issimilrità riportto in Fig. ui è emers un vriilità non troppo lt tr le linee. Fig. - Denrogrmm ottenuto meinte nlisi luster (Averge Linkge metho between groups) sull bse ei ti morfologii rilevti sulle 7 linee i ee

5 ANALISI AFLP Diinnove mpioni i ee e 9 i lupino zzurro ( gruppo i linee rtterizzte morfologimente urnte il semestre i ttività) sono stti genotipizzti utilizzno rispettivmente 9 e 0 ombinzioni i primer AFLP. E stto risontrto un totle i prootti i mplifizione per il ee e per il lupino zzurro (T. ). T. - Anlisi AFLP i genotipi i lupino e ee Combinzioni i BANDE primer totli monomorfihe polimorfihe frequenz polimorfihe (%) Cee Eo-ACA-Mse-CTT 6, Eo-ACA-Mse-CAA 0 0,0 Eo-ACT-Mse-CAC 0,0 Eo-AGC-Mse-CAA 0 0,0 Eo-AGC-Mse-CTT 0,0 Eo-ACT-MseCAA, Eo-ACT-MseCTT ,0 Eo-AGT-MseCAC 7,7 Eo-AGT-MseCGA 0 0,0 Totle Lupino Eo-ACA-Mse-CTT 9 7,7 Eo-ACA-Mse-CAA 6 9, Eo-ACT-Mse-CGA 8 0,0 Eo-ACT-Mse-CAC 7 6 8,6 Eo-AGC-Mse-CAA 0 6, Eo-AGC-Mse-CTT 8 7, Eo-ACT-MseCAA 0 7 6, Eo-ACT-MseCTT 8 7,9 Eo-AGT-MseCAC 7 6, Eo-AGT-MseCGA 8 8, Totle 66 7 In ee, il numero i prootti polimorfii er ompreso tr e per ombinzione i primer (T. ), orrisponenti un perentule vriile tr 0 e,7% (in mei,%). Il peso moleolre ei prootti i mplifizione vriv 8 bp (E-AGC/M-CTT) 09 bp (E-AGT / M- CAC). Il numero meio i bne per rezione er, on un vrizione ompres tr 8 (E-ACT / M-CTT) e (E-ACA / M-CTT) (T. ). Nel lupino zzurro, l perentule i polimorfismo vriv tr il 7,7% e il 8,% (in mei,0%), mentre il peso moleolre ei prootti i mplifizione vriv tr bp (E-ACT/M-CGA) e 00 bp (E-AGA/M-CTG ). Il numero meio i bne per rezione er, on un vrizione ompres tr 8 (E-AGT / M-CGA) e 0 (E-ACT / M-CAA) (T. ). Dopo nlisi AFLP, sono stti ostruiti i reltivi enrogrmmi he mostrno l

6 suivisione elle linee i ee in 7 sub-lusters (Fig. ) e i quelle i lupino gruppo in sublusters (Fig. ) MW Coeffiient Fig. Denrogrmm i similrità geneti tr le linee i ee nlizzte (DICE inex, UPGMA) Coeffiient Fig. Denrogrmm i similrità geneti tr le linee i lupino zzurro nlizzte nlizzte (DICE inex, UPGMA) Anhe on i ti moleolri, i vlori i issimilrità ottenuti per il enrogrmm reltivo, lolti ome istnze qurtihe Euliee, hnno evienzito un vriilità reltivmente tr le linee rtterizzte. RESISTENZA AD ASCOCHYTA RABIEI IN CECE Le linee i ee, rtterizzte un punto i vist biogronomio e moleolre, sono stte vlutte nhe per resistenz A. riei, il ptogeno più temibile per l oltur el ee. Vlutte in onizioni nturli i infezione in mpo Trquini urnte il 008 e sottoposte tre rilievi effettuti in iversi sti i sviluppo ell pint, le linee ontrssegnte i numeri,, 6, 7, 8, 9 e hnno evienzito un rispost i resistenz l fungo on inienz ei sintomi <,, seono l sl -9 utilizzt ll ICARDA per le vlutzioni in mpo, nhe l rilievo effettuto ll metà i giugno, quno ormi l pint vev rggiunto lo stio i mturità e i virggio el olore (Fig. 6). Aspetto i un pintin i ee ttt A. riei e prtiolri ei sintomi su belli, stelo e foglie 6

7 mg-08 9-mg-08 -giu-08 7 Rezione A. riei (sl -9*) 6 f b b b e b b f f f f f b ef ef ef Genotipo *-=resistente -=moertmente resistente 6-9=susettibile Fig. 6 Selezione per resistenz A. riei nelle linee i ee vlutte gronomimente in mpo Trquini Quinii genotipi sono stti inoltre sottoposti inoulzione rtifiile in mbiente ontrollto per vlutre le risposte un isolto speifio e molto iffuso (rzz ) el fungo. L isolto fungino è stto in gro i ifferenzire signifitivmente le risposte ei genotipi ogni singolo rilievo evienzino l rispost i resistenz soprttutto per i genotipi,, 6, 9, 0,, e 6, risultte resistenti nei onfronti ell rzz (Fig. 7), on inienz i mltti inferiore, (limite ell moert resistenz seono l sl 0- utilizzt in mbiente ontrollto). Rezione A. riei (sl 0-*) be f eg f f f ef f f be ef ef linee *0-,=resistente >,=susettibile Fig. 7 Selezione per resistenz A. riei in onizioni ontrollte effettut sulle linee i ee 7

8 Dl momento he le onizioni meterologihe, urnte l nnt grri 008, sono stte prtiolrmente fvorevoli llo sviluppo ell rbi, è stto possibile effetture ulteriori vlutzioni reltivmente si ll epo he ll ensità i semin (ollorzione on l U.O. UNITUS- GEMINI). I genotipi resistenti 90 e si sono mntenuti resistenti si on l I he on l II epo i semin mentre il genotipo ontrssegnto Psià Su, resistente urnte l I epo è iventto susettibile on l II (Fig. 8). A riguro, bisogn onsierre he, ontrrimente qunto tteso on le semine primverili meno fvorevoli llo sviluppo el fungo, in questo so, le piogge molto frequenti e bonnti verifitesi urnte l primver rispetto ll inverno hnno invertito il omportmento elle linee reltivmente ll inienz ei sintomi presenti. 9 epo epo 8 Rezione A. riei (sl -9*) 7 6 b b 90 Foggi Psià Su Psià nor 90 Genotipo Foggi Psià su Psià nor *-=resistente -=moertmente resistente 6-9=susettibile Fig. 8 Effetto ell epo i semin sull inienz i A. riei su linee selezionte i ee Anhe in onizioni iverse i ensità i semin e in onizioni fvorevoli ll selezione, l line resistente si è sempre mntenut tle ifferenzino bene l su rispost quell ell line susettibile (Fig. 9). In onizioni sfvorevoli ll selezione, rtterizzte elevt UR, non è possibile isriminre l rezione ei ue genotipi. 8

9 Rezione A. riei (sl -9*) onizione sfvorevole ll selezione on lt HR R S onizione fvorevole ll selezione 0 D D D D D D D D Densità i semin *-=resistente -=moertmente resistente 6-9=susettibile Fig. 9 Effetto ell ensità i semin sull inienz i A. riei in ue linee i ee, un resistente e un susettibile l fungo In Fig. 0 e 0b sono evienti i sintomi ell infezione si sugli steli he sulle foglie opo inoulzione rtifiile in onizioni ontrollte on il fungo ben visibili lune prti elle pinte ormi ompletmente morte. b Fig. 0 - Effetto i rottur egli steli prte el fungo Nelle seguenti foto (Fig., b,,, e, f) è esritt l inienz ell mltti seono gli inii ell sl 0- utilizzt. 0 Fig. - Inie ei sintomi utilizzti nell sl i vlutzione 0- (0=pint sn; f=pint mort) 9

10 CONCLUSIONI Le linee i ee hnno mostrto un ert vriilità e è stto possibile isriminre gruppi i queste si un punto i vist morfologio he moleolre. Questo risultto non er el tutto hiro ll fine el I semestre m l impiego i un numero mggiore i primer nell nlisi AFLP h onsentito un migliore istinzione. Un o ue linee si sono rivelte più interessnti si un punto i vist gronomio he prouttivo. Contrrimente l ee, le linee i lupino zzurro hnno onfermto un bss vriilità geneti onfermno i risultti el I semestre i ttività el progetto. D un punto i vist moleolre, il primo gruppo i 7 linee è stto suiviso in sub-luster. L nlisi morfologi effettut su un seono gruppo i linee h nor suiviso il mterile in soli ue sub-luster inino, nhe in questo so, un bss vriilità tr le linee. Riguro ll resistenz A. riei effettut, 9 linee hnno mostrto resistenz l fungo in onizioni in onizioni nturli i inoulo (in mpo). Sette linee hnno onfermto l resistenz nhe in onizioni ontrollte i inoulo (in mer limtizzt). L epo i semin svolge un ruolo notevole sull inienz i mltti in mpo mentre l ensità i semin non sembr vere molt influenz. PUBBLICAZIONI O PRESENTAZIONI A CONVEGNI Crinò P., Sro F Cee e lupini itlini: nor un risors. L Informtore Agrrio 7: 7-9. Crinò P., Fiohetti F., Roselli M., Rossini F., Olimpieri D., Primi R., Ronhi B., Sro F. (in stmp). Vlorizzzione i germoplsm lole i Lupinus ngustifolius L. Itlus Hortus. Crinò P., Sro F Innovzione vrietle in leguminose grnell. Convegno ARSIAL, Trquini, Diembre 007. Rom settembre 009 Il Responsile Sientifio ell Unità Opertiv Dott.ss Pol Crinò 0